翟映雪，冷云，衣堯，王振

1(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島，266042)

2(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266109)

微藻中存在著大量的、結(jié)構(gòu)特殊的有機(jī)化合物，如油脂、多不飽和脂肪酸(PUFA)、色素、多糖等［1］，且具有生物量積累快，蘊(yùn)量豐富等特點(diǎn)而備受研究者關(guān)注。微藻生物易受脅迫環(huán)境條件(如光照、溫度和營養(yǎng)鹽限制等)的影響，使其生理機(jī)能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致微藻的生化成分發(fā)生較大的改變［2］。氮饑餓使藻體中的蛋白質(zhì)和碳水化合物的比例變化明顯，為儲(chǔ)存光合作用產(chǎn)生的能量，保護(hù)光合作用器官免受光抑制的傷害，藻體細(xì)胞合成大量油脂以保證藻體正常生長［3］。光照條件是影響藻類光合作用以及生物量積累的重要因素，PUFA合成、類脂的含量、以及PUFA在總脂中的相對含量都與光照強(qiáng)度有密切的聯(lián)系［4］。處于不同光照條件下的藻體其色素成分發(fā)生改變也是細(xì)胞為避免因光照而受到損害的一種保護(hù)機(jī)制［5］。

缺刻緣綠藻(Parietochloris incisa)是一種單細(xì)胞球狀綠藻。它不僅具有一般微藻生長繁殖速度快，易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，最為有價(jià)值的是它的細(xì)胞中含有豐富的花生四烯酸(arachidonic acid，AA)［3］。AA是人體必需的高度不飽和脂肪酸，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中起重要作用的白三烯和前列腺素的前體、母乳成分［6］，具有重要的生物學(xué)功能。近年來，國內(nèi)對缺刻緣綠藻的研究大多是關(guān)于分子生物學(xué)［6－9］方面的。營養(yǎng)鹽缺失條件(如氮、磷)對AA 積累的影響也有較多報(bào)道［3，10］，但對其油脂和色素影響的報(bào)道則很少。為此，本文以缺刻緣綠藻為材料，在氮饑餓能提高該藻AA含量的研究基礎(chǔ)上，考慮藻類在脅迫條件下細(xì)胞中特殊的有機(jī)化合物發(fā)生改變，主要研究了氮源和不同光強(qiáng)對缺刻緣綠藻生長，色素，總脂和AA積累的影響，并分析了AA與油脂產(chǎn)量的關(guān)系，以期為AA的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，為大規(guī)模培養(yǎng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

缺刻緣綠藻(Parietochloris incisa)H4301，購自布拉格查理大學(xué)藻類培訓(xùn)中心(CAUP)。

1.2 培養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)設(shè)置

將藻接種于 BG－11培養(yǎng)基［11］，培養(yǎng)溫度為25℃，熒光燈提供光源，光照和黑暗時(shí)間比為12 h∶12 h。向培養(yǎng)基中充入過濾空氣，培養(yǎng)至對數(shù)期(約14 d)。

實(shí)驗(yàn)在直徑為6 cm柱狀光合生物反應(yīng)器中進(jìn)行。離心收集藻體，調(diào)整離心機(jī)轉(zhuǎn)速為5 500 r/min，離心5 min后將藻細(xì)胞轉(zhuǎn)入新鮮的或缺氮(培養(yǎng)基中不添加NaNO3)的BG－11培養(yǎng)基中，分別于35 μmol photons/(m2·s)，130 μmol photons/(m2·s)，280 μmol photons/(m2·s)光照強(qiáng)度下培養(yǎng)。設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 生物量的測定

預(yù)先將15 mL離心管干燥并稱重。取10 mL培養(yǎng)至16 d的藻液于離心管中，離心去除培養(yǎng)基并用蒸餾水清洗3次，在鼓風(fēng)干燥器中于95℃下烘干至恒重。稱量干燥后含有藻體的離心管并減去空管的質(zhì)量以得到藻體的干重。

1.4 總脂含量的測定

參照 Zhekisheva［12］的方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取 50 mg凍干藻粉氯仿、甲醇混合溶液(體積比1∶2)，超聲連續(xù)破碎5 min，至藻體發(fā)白。5 500 r/min離心10 min后取上清液于離心管中。上清液中加入適量的氯仿和1%NaCl溶液中，使氯仿∶甲醇∶1%NaCl體積比為1∶1∶1，離心分層。取下層于已經(jīng)干燥、稱重的離心管中，50℃氮?dú)獯抵梁阒亍?/p>

1.5 花生四烯酸含量分析

將提取的總脂置于10 mL具塞試管中，加入KOH-甲醇溶液5.00 mL，再加20.00 μL濃度為1.50 mg/mL的十九碳酸內(nèi)標(biāo)，混勻，充氮?dú)獗Ｗo(hù)，置于60℃水浴環(huán)境下皂化60 min。將皂化好的樣品取出冷卻后加入HCl-甲醇(體積比1∶9)溶液4.0 mL，混勻，在60℃水浴甲酯化20 min，將甲酯化好的樣品冷卻后加入飽和食鹽水3.00 mL，加入正己烷1.00 mL，充分振蕩，靜置，取正己烷層用無水Na2SO4脫水后進(jìn)行色譜分析［13］。樣品經(jīng)氣相色譜儀分析(安捷倫7890A/5975C)，面積歸一法計(jì)算花生四烯酸的相對百分含量。

1.6 色素含量測定

取50.00 mL藻液，5 500 r/min離心3 min，藻體沉淀加入5.00 mL DMSO放于70℃水浴鍋中5 min。8 000 r/min離心2 min取上清液。測定上清液在480 nm、650 nm 和 666 nm 處的吸光度，用 Solovchenko［14］的公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和總類胡蘿卜素的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果值為:平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3);數(shù)據(jù)結(jié)果選用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光強(qiáng)、氮源對缺刻緣綠藻生長的影響

不同光強(qiáng)、氮源對缺刻緣綠藻生物量的影響如圖1。在 35 μmol photons/(m2·s)低光照強(qiáng)度下，有氮源培養(yǎng)基和無氮源培養(yǎng)基中的藻體生長都是相對緩慢的，其藻體最終生物量分別達(dá)到2.87 g/L和3.10 g/L。在 135 μmol photons/(m2·s)中等光強(qiáng)下，有氮源培養(yǎng)基中藻體的生物量以平均每天0.46 mg的速度增長，16 d后最終達(dá)到6.10 g/L，該藻在無氮源培養(yǎng)基中平均以0.26 mg/d的速度增長，最終生物量為4.28 g/L，有氮源培養(yǎng)基中藻體生物量是相同光強(qiáng)下無氮源培養(yǎng)基的1.43倍。在280 μmol photons/(m2·s)高光照強(qiáng)度下，有氮源培養(yǎng)基中藻體的最大生物量(7.30 g/L)是無氮源培養(yǎng)基中藻體最大生物量(4.18 g/L)的1.75倍。上述結(jié)果表明在中、高光照強(qiáng)度下，有氮源的培養(yǎng)基更有利于該藻生物量的增加。

圖1 不同脅迫條件下缺刻源綠藻的生物量Fig.1 The biomass of Parietochloris incisa in different stress conditions

2.2 總脂肪酸含量分析

不同光強(qiáng)，氮源對缺刻緣綠藻總脂肪酸含量的影響結(jié)果見圖2。在有氮源培養(yǎng)基中，低光照強(qiáng)度培養(yǎng)的藻體，總脂肪酸含量僅僅由9.89%增加到10.28%，增加量極為不顯著(P＞0.05);135 μmol photons/(m2·s)中等光照強(qiáng)度藻體培養(yǎng)至第16天總脂肪酸含量達(dá)到19.69%，較初始含量提高了99.09%;相同培養(yǎng)基中，最高的總脂肪酸含量為280 μmol photons/(m2·s)高光照強(qiáng)度下培養(yǎng)的藻體，在培養(yǎng)至第16天后達(dá)到32.78%，較初始含量提高了231.44%。無氮源培養(yǎng)基中的藻體，在低、中、高3種光強(qiáng)下總脂肪酸的含量均成上升趨勢，在第16天達(dá)到最大值，最大值分別為 23.22%，32.75%，38.02%。3者增加的總脂肪酸含量均較為顯著(P＜0.05)，分別為初始含量的1.93倍，2.73倍和3.17倍。

圖2 不同脅迫條件下缺刻源綠藻總脂肪酸含量(A:有氮源培養(yǎng);B:無氮源培養(yǎng))Fig.2 The total fatty acids of Parietochloris incisa in different stress conditions

2.3 花生四烯酸含量分析

不同光強(qiáng)，氮源對缺刻緣綠藻總脂含量的影響結(jié)果見圖3。在所有培養(yǎng)條件下，藻體中花生四烯酸的含量都呈上升趨勢，同樣光照強(qiáng)度下，無氮培養(yǎng)基中產(chǎn)物積累量相對更高。中等光照強(qiáng)度無氮源條件下，獲得花生四烯酸產(chǎn)量最高，為16.10%。

在培養(yǎng)大值件中體總脂肪酸增加量呈現(xiàn)相似的趨勢花生四烯酸含量與總脂肪酸含量的相關(guān)性分析如圖4?；ㄉ南┧岷颗c總脂肪酸含量呈一定線性關(guān)系(P＜0.05，r2=0.67)，兩者有相似的增長趨勢。

2.4 色素成分分析

不同光強(qiáng)，氮源對缺刻緣綠藻葉綠素、類胡蘿卜素含量的影響結(jié)果見圖5。在有氮源培養(yǎng)基中，低光照下培養(yǎng)的藻體葉綠素含量呈緩慢上升的趨勢;高光照強(qiáng)度下培養(yǎng)的藻體葉綠素含量在第8天達(dá)到最大值，最大含量為80.60 mg/L，隨后葉綠素的含量逐漸下降;中光照強(qiáng)度下培養(yǎng)的藻體葉綠素含量明顯高于前兩者(P＜0.05)，第12天達(dá)到最大值，為150.20 mg/L。在無氮源培養(yǎng)基中藻體葉綠素含量均為下降趨勢。低、中光照強(qiáng)度培養(yǎng)基中藻體葉綠素含量在培養(yǎng)前4天緩慢地上升隨后開始下降，而在高光照強(qiáng)度培養(yǎng)基中藻體葉綠素含量一直呈下降趨勢。

在有氮源培養(yǎng)基中，無論光線強(qiáng)弱，類胡蘿卜素含量在培養(yǎng)的前12天中均呈上升趨勢，中、高光照強(qiáng)度培養(yǎng)基中類胡蘿卜素含量增加趨勢明顯，并在第12天達(dá)到最大值，低、中、高光照強(qiáng)度培養(yǎng)基中類胡蘿卜素含量的最大值分別為16.52、31.93、24.84 mg/L，隨后都呈現(xiàn)下降趨勢。無氮源培養(yǎng)基中藻體類胡蘿素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有氮源培養(yǎng)基中類胡蘿卜素含量，無論光照度強(qiáng)弱，其最大類胡蘿卜含量均不超過10.00 mg/L。

圖3 不同脅迫條件下缺刻源綠藻花生四烯酸的含量(A:有氮源培養(yǎng);B:無氮源培養(yǎng))Fig.3 The arachidonic acid of Parietochloris incisa in different stress conditions

圖4 缺刻源綠藻總脂肪酸含量與花生四烯酸含量的相關(guān)性分析Fig.4 The relationship between total fatty acids and arachidonic acid in Parietochloris incisa

圖5 不同脅迫條件下缺刻源綠藻的色素含量Fig.5 The pigment content of Parietochloris incisa in different stress conditions

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光照強(qiáng)度和氮源都是影響缺刻源綠藻生長的重要因素。在高光照有氮源培養(yǎng)基中缺刻源綠藻達(dá)到最大的生物量，而在無氮源培養(yǎng)基中，其生長速度較慢且生物量較低。這與Solovchenko［14］的研究結(jié)果一致。缺刻源綠藻生物量和脂肪酸積累的數(shù)據(jù)符合Ahmad［15］做出的假設(shè):綠藻油脂的積累取決于培養(yǎng)基中碳、氮元素的平衡。所以，在低光照和中等光照強(qiáng)度下，培養(yǎng)前3 d生物量快速積累而總脂肪酸含量有下降趨勢。在高光照條件下，藻體細(xì)胞的碳、氮比例發(fā)生改變，即使在無氮源培養(yǎng)基中，油脂均開始積累。殷大聰［16］等報(bào)道，光照強(qiáng)度在光飽和點(diǎn)以下，微藻的光合作用隨著光強(qiáng)的提高而加強(qiáng)，從而促進(jìn)生長。本實(shí)驗(yàn)中，在無氮源中等光強(qiáng)培養(yǎng)下的藻體光合作用達(dá)到飽和點(diǎn)，這使藻體生長停止，在培養(yǎng)的3～4 d后總脂肪酸含量積累?？梢哉J(rèn)為，光照強(qiáng)度對生長油脂含量油脂產(chǎn)量的影響表現(xiàn)為適宜生長的光強(qiáng)促進(jìn)油脂積累并提高油脂產(chǎn)量。

本研究對缺刻源綠藻花生四烯酸(AA)的研究表明，處在無氮源培養(yǎng)基中的藻體其含量高于有氮源的藻體中的含量。微藻在缺氮時(shí)同化產(chǎn)物多轉(zhuǎn)化為糖類或脂類物質(zhì)，通常會(huì)增加多飽和脂肪酸的含量。KhozinGoldberg［17］等認(rèn)為缺刻緣綠藻對氮饑餓的第一應(yīng)答反應(yīng)是大量積累AA。在氮饑餓條件下，AA的含量可增加到占總脂肪酸的60%。本實(shí)驗(yàn)在中等光照缺氮源條件下達(dá)到最大 AA含量，為干重的16.10%。Cohen［18］等對紫球藻的研究也發(fā)現(xiàn)氮饑餓會(huì)導(dǎo)致AA的含量升高。光照是影響光合自養(yǎng)微藻多不飽和脂肪酸(PUFA)合成的重要因素，它不僅影響藻體中類脂的含量，還影響各種PUFA在總脂中的相對含量。就AA百分含量的變化而言，光照強(qiáng)度會(huì)對無氮源培養(yǎng)基中的藻體表現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)，但高光照強(qiáng)度并不利于缺刻緣綠藻AA積累，有研究表明，擬微球藻中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象發(fā)生［19］。還有研究發(fā)現(xiàn)［20］，低光照下培養(yǎng)的紫球藻脂肪酸中積累較多的AA，但是在高光照下情況剛好相反。高光照強(qiáng)度伴隨光損傷現(xiàn)象的發(fā)生，單不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸百分含量增加可能的原因是其在降低光強(qiáng)帶來的損傷以及維持細(xì)胞中水分平衡起著一定的作用，但PUFA含量則與前者相反。在缺氮條件下，中等、低光照強(qiáng)度均能提高缺刻緣綠藻AA的百分含量，與Solovchenko 和 Ahmad［14－15］報(bào)道的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)證明，在一定范圍內(nèi)控制光強(qiáng)和氮源有利于缺刻源綠藻花生四烯酸的積累。

藻類色素積累受多種環(huán)境因素的影響，如光照、營養(yǎng)鹽、溫度等。本實(shí)驗(yàn)在不同光強(qiáng)和氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)缺刻源綠藻其色素成分和含量都有顯著變化。本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明藻體在缺氮源培養(yǎng)基中類胡蘿素的合成能力受到限制，同時(shí)隨著光強(qiáng)的增加葉綠素的含量也有所下降。這與Merzlyak［2］等得研究結(jié)果基本吻合。在本實(shí)驗(yàn)中，中等光強(qiáng)和高光強(qiáng)無氮源培養(yǎng)基中缺刻源綠藻葉綠素含量顯著低于有氮源培養(yǎng)中的藻體葉綠素含量，說明葉綠素含量是反映藻類光合強(qiáng)度的重要指標(biāo)，在一定光強(qiáng)下氮限制使葉綠素的合成受到一定抑制，該結(jié)果與硅藻和雪藻的相關(guān)研究報(bào)道一致［21－22］。這主要是在氮限制條件下類囊體膜上捕光色素蛋白復(fù)合物和反應(yīng)中心復(fù)合體受到一定損傷或部分降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)能效率降低。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有氮源的培養(yǎng)基和一定光強(qiáng)均有利于缺刻源綠藻的生長，有氮源高光強(qiáng)培養(yǎng)條件下，該藻的生物量達(dá)到最大值，為7.23 g/L。無氮源培養(yǎng)基和一定光強(qiáng)度均能不同程度地提高藻細(xì)胞總脂肪及花生四烯酸的含量，且在無氮源高光強(qiáng)條件下油脂量最高，約為38.02%;在缺氮源中光強(qiáng)條件下花生四烯酸含量最高，約為16.10%。色素含量在缺氮條件下隨著光強(qiáng)的上升而下降，在有氮源中光強(qiáng)條件下達(dá)到最大值，約為150.00 mg/L。類胡蘿卜素含量無論是在有氮源還是無氮源培養(yǎng)基中，中等光強(qiáng)下含量均較高。

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