張輝，喬勇進，戚文元

1(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，上海，201403)

2(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)3(上海束能輻照技術(shù)有限公司，上海，201401)

大麥(Hordeum vulgare)，屬大麥屬(Hordeum)，早熟禾科(Poaceae)，其嫩苗富含葉綠素、類黃酮、維生素、抗氧化酶及蛋白質(zhì)等多種功能營養(yǎng)成分［1－2］。據(jù)報道大麥苗黃酮類化合物主要有皂草苷(saponarin)和大麥黃苷(lutonarin)［3－4］，其自由基清除能力和抗氧化性能顯著高于其他植物黃酮和黃酮碳苷［5］，具有抗癌、抗炎及防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等生理功能［6－7］。目前，天然植物黃酮類化合物提取原料有銀杏葉［8］、杜仲葉［9］及玉米須［10］等。以大麥苗為原料進行總黃酮定向提取并對其提取工藝參數(shù)進行響應(yīng)面法優(yōu)化的研究鮮有報道。大麥苗因其原料具有種植周期短、成本低、產(chǎn)量大、易加工及副產(chǎn)物利用價值大等優(yōu)點，可作為總黃酮提取的原料。已有研究表明超臨界流體萃取、超聲波及微波輔助提取可增加植物黃酮類化合物的提取量［11－13］，而本文以乙醇溶液為提取溶劑，對大麥苗總黃酮進行常溫浸漬提取，采用中心組合試驗設(shè)計(central composite design，CCD)，優(yōu)化其最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六葉期大麥苗(品種:大中88－91)，采收于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田;無水乙醇(分析純 )、NaNO2(BR)、AlCl3(BR)、NaOH(BR)、蘆丁(純度 ＞95%)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 葉綠素提取工藝流程

大麥苗鮮樣→挑選、清洗、瀝干→真空冷凍干燥(預(yù)凍溫度，－45℃;冷阱溫度，－37℃;升華溫度，25℃;真空度，170 Pa)→粉碎(100目)→浸提→過濾→濾液→減壓濃縮成膏狀(水浴溫度，30℃;真空度，110 Pa)

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比和提取時間等3個因素均對大麥苗總黃酮提取量影響較大。故分別取其不同水平進行單因素試驗，每組試驗均進行3次平行試驗，取其平均值進行研究。

1.3.2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對大麥苗總黃酮提取效果的影響

將粉碎干燥后的大麥苗過100目篩，稱取麥苗粉約2.50 g，置于250 mL錐形瓶中，按液固比為30∶1(mL∶g)加入乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以150 r/min轉(zhuǎn)速搖晃浸提90 min，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對大麥苗總黃酮提取效果的影響。

在經(jīng)歷了這樣特殊的課程之后，從新加坡中學(xué)走出來的學(xué)生具有非常敏銳的“批判性思維”和“辯證思維”，他們的邏輯思維能力快速成長，也同樣對于他們的學(xué)術(shù)課程大有助益。

1.3.2.2 不同液固比對大麥苗總黃酮提取效果的影響

將粉碎干燥后的大麥苗過100目篩，稱取麥苗粉約2.50 g，置于250 mL錐形瓶中，按液固比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL∶g)加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以150 r/min轉(zhuǎn)速搖晃浸提90 min，研究不同液固比對大麥苗總黃酮提取效果的影響。

1.3.2.3 不同提取時間對大麥苗總黃酮提取效果的影響

將粉碎干燥后的大麥苗過100目篩，稱取麥苗粉約2.50 g，置于250 mL錐形瓶中，按液固比為30∶1(mL∶g)加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以150 r/min轉(zhuǎn)速搖晃分別浸提 30、60、90、120、150 min，研究不同提取時間對大麥苗總黃酮提取效果的影響。

1.3.3 中心組合試驗設(shè)計

采用中心組合試驗設(shè)計對大麥苗總黃酮提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定了CCD的試驗水平(表1)。根據(jù)試驗結(jié)果，可建立二次非線性回歸模型(式 1)［14］。

式中:Y，總黃酮提取量預(yù)測值;Xi，Xj，試驗因素的編碼值;β0，βii，βij，截距及回歸常數(shù)(其中，Xi=，式中X為無量綱的編碼值，x為變量i的實ii際值，xio為變量i的零水平實際值。Δxi為變量i的步長實際值，即編碼值變化一個單位所對應(yīng)的實際變化值)。

因子貢獻率采用式(2)計算［15］:

式中:SSj，因子平方和，SST，模型總平方和。

表1 中心組合試驗設(shè)計因子及編碼水平Table 1 Values factors and their coded levels in central composite experimental design

1.3.4 指標(biāo)測定

浸提完成后將提取液置于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下低溫(10℃)離心15 min，取1 mL上清液，采用硝酸鋁比色法［16］測定其總黃酮含量?？傸S酮提取量采用式(3)進行計算。

式中:Y，大麥苗總黃酮提取量，μg/g;m，提取液中總黃酮含量，μg/mL;M，提取樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

CCD試驗數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.0.6.1(State-Ease，Inc.，USA)、SAS 9.2(SAS Inc.，USA)，Origin 8.0(Electronic Arts Inc.，USA)繪制單因素圖及效應(yīng)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1表明，大麥苗總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增高。乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%時，總黃酮提取量最高。這可能是由于大麥苗中黃酮類化合物為弱極性物質(zhì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，其極性越接近大麥苗中黃酮類化合物的極性，導(dǎo)致總黃酮溶出量升高。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the flavonoids extraction yield

液固比對液相主體和固相主體之間的濃度差，即傳質(zhì)推動力，影響較大。此外，液固比也會影響液固兩相的表觀傳質(zhì)系數(shù)，從而影響傳質(zhì)速率。圖2表明，隨著液固比的增加，大麥苗總黃酮提取量呈現(xiàn)先快速升高而后增加平緩的趨勢。這是因為增加液固比，傳質(zhì)動力增加，黃酮就更容易溶出，損失減少;但液固比大于30 mL/g后增加速度趨于平緩。由于液固比較大會造成提取溶劑的浪費及后期濃縮的困難，從總黃酮提取效果和經(jīng)濟邊際效應(yīng)兩方面綜合考慮，認為進行大麥苗總黃酮提取時液固比不宜高于40 mL/g。

圖2 液固比對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the flavonoids extraction yield

由圖3可知，總黃酮提取量隨著提取時間的延長呈現(xiàn)先逐漸升高而后降低的趨勢。大麥苗總黃酮提取量在提取時間為120 min時達到最大值，而在提取時間為150 min時略微降低。這可能因為延長提取時間使得更多的黃酮類化合物溶出，但一些黃酮類化合物易于氧化，提取時間過長會導(dǎo)致總黃酮的溶出量小于其降解量，從而使得其提取量略微降低。

圖3 提取時間對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the flavonoids extraction yield

2.2 CCD試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立

試驗共設(shè)20次試驗，其中包括14次析因試驗及6次中心點試驗。所有試驗均進行3次平行試驗，取其平均值作為響應(yīng)值，試驗按隨機順序進行，其結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 8.0軟件對表2結(jié)果進行統(tǒng)計分析，并建立三元二次回歸方程(式3):

表2 CCD設(shè)計矩陣及響應(yīng)值Table 2 Central composite design matrix and responses

2.2.2 回歸模型的統(tǒng)計檢驗

由表3可知，判定系數(shù)(R2)為0.994 3，說明模型相關(guān)性較好，試驗因子對響應(yīng)值有較大影響。校正判定系數(shù)(adjR2)為0.989 1，表明98.91%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。變異系數(shù)(C.V.)為1.66%，表示試驗的可信度和精確度較好。本試驗精密度(adeq precision)為40.536 ＞4.0，表明其為一個適宜的信號。模型 F值為192.61，表明其達到極顯著水平(P＜0.01)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比及提取時間等影響因素對總黃酮提取量的共同影響具有差異極顯著性，且模型一次項、二次項均達到顯著水平。此外，失擬F值為1.54(P=0.323 2＞0.05)，表明失擬值和純誤差沒有顯著性關(guān)系，即回歸模型在被研究的整個回歸區(qū)域不失擬。綜上可知，該所建立模型可用于指導(dǎo)試驗。此外，表3還表明，各一次項 、二次項和交互項X2X3、X1X3均對大麥苗總黃酮提取量影響極顯著(P＜0.01)，交互項X1X2對總黃酮提取影響不顯著 (P＞0.05)。

表3 回歸模型顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Results of regression model significance test

圖4 因子貢獻率Fig.4 Percentage contributions of factors

2.2.3 模型效應(yīng)分析

2.2.3.1 主效應(yīng)分析

由于模型存在交互效應(yīng)，故不宜采用回歸系數(shù)的絕對值大小來直接比較二次項、交互項作用的大小。因此，本試驗均采用因子貢獻率來衡量各因子對總黃酮提取量的影響大小。圖4－a表明，二次項效應(yīng)＞一次項效應(yīng)＞交互項效應(yīng)。圖4－b表明，模型各項間乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次效應(yīng)影響最顯著，其次是其液固比，而乙醇體積分?jǐn)?shù)及液固比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對黃酮提取量影響最小。3個試驗因素的效應(yīng)大小依次為液固比 ＞提取時間 ＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.3.2 兩因素效應(yīng)分析

由圖5－a、5－c知，大麥苗總黃酮的提取量隨液固比的增加呈現(xiàn)先快速增長再緩慢增長的趨勢。液固比的增加可增加傳質(zhì)動力，有助于總黃酮的溶出，但當(dāng)液固比達到一定程度時，已溶出大部分總黃酮，若再增加液固比，則總黃酮提取量增加緩慢。由5－a、5－e可看出，總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增大而后減小的趨勢。這可能是由于在一定范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大減小了提取液極性，使其更接近于總黃酮的極性，從而增加了總黃酮的溶出。但過度增加乙醇體積分?jǐn)?shù)會導(dǎo)致提取液極性過小，從而偏離大麥苗總黃酮極性。5－c、5－e均表明，大麥苗總黃酮提取量隨著提取時間的延長曾先前期增加迅速，后期增加緩慢的趨勢。這可能是由于前期已溶出大部分黃酮，后期原料自身黃酮較少，故增加緩慢;也可能由于后期有部分黃酮發(fā)生降解，但降解速率仍小于溶出速率，從而呈現(xiàn)增長緩慢的現(xiàn)象。圖5－b為液固比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線圖，其接近圓形，表明二者交互作用不顯著，圖5－d、5－e分別為液固比與提取時間的等高線圖及乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間的等高線圖，其均為橢圓形狀，表明二者交互效應(yīng)顯著，這均與方差分析結(jié)果一致。

圖5 總黃酮提取量響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots of total flavonoids extraction yield

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化與模型驗證

規(guī)范分析［17］(canonical analysis)能求出響應(yīng)面的拐點并判斷其類型(最大值點、最小值點、馬鞍形點)。對試驗結(jié)果進行規(guī)范分析(表4)，得到大麥苗總黃酮提取的一個穩(wěn)定點，該點處理論響應(yīng)值為950.36。由于變量X2的編碼值的特征值為0.02，其較接近零值，在試驗區(qū)域內(nèi)可能會存在一個穩(wěn)定嶺系統(tǒng)，故一般需進行嶺脊分析。

表4 規(guī)范分析結(jié)果Table 4 Results of canonical analysis

嶺脊分析(aidge analysis)是在以原始設(shè)計中心點為球心，以r為半徑的超球面與響應(yīng)面的交點所形成的軌跡范圍內(nèi)探測最佳響應(yīng)值［17］。嶺脊分析結(jié)果(表 5)表明當(dāng)超球面半徑(r)為 0.8，X1、X2、X3的特征值分別為 0.728 876、0.021 37、0.329 069 時，響應(yīng)值達到最大(950.346 3 μg/g)，其與規(guī)范分析所得的穩(wěn)定點較一致，故無穩(wěn)定嶺系統(tǒng)的存在，穩(wěn)定點為理論上的最優(yōu)點。

表5 脊嶺分析結(jié)果Table 5 Results of ridge analysis

考慮到試驗操作的便利，將總黃酮提取工藝參數(shù)修正為液固比29、乙醇體積分?jǐn)?shù)90% 、提取時間100 min。采用修正后的工藝參數(shù)進行3次平行驗證試驗，試驗結(jié)果測得大麥苗總黃酮提取量為946.63 μg/g，與模型預(yù)測值相差 3.73 μg/g，差異在誤差允許范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本試驗通過CCD試驗設(shè)計建立了影響因子與大麥苗總黃酮提取量之間的三元二次回歸模型，確定了大麥苗總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為液固比29 mL/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)90% 、提取時間100 min，在此工藝條件下，大麥苗總黃酮提取量為946.63 μg/g，其與預(yù)測值950.36 μg/g較一致。故該模型能反映大麥苗總黃酮提取過程的內(nèi)部規(guī)律，可較好地預(yù)測大麥苗總黃酮的提取情況，并能為黃酮類化合物提取原料的來源、進一步提高大麥嫩苗資源利用率及大麥苗黃酮類化合物工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

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