王偉潔，李紅梅，薛芳，高露嬌，黃艷青

1(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海，200093)

2(中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)

核苷磷酸化酶分3類:嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶［1］，其中胸苷磷酸化酶主要用來合成核苷類藥物，在“補救途徑”中催化脫氧胸苷可逆磷酸化反應，提供2-脫氧核糖-1-磷酸，釋放堿基胸腺嘧啶，加入另一種堿基生成新的核苷，在腫瘤治療中有著重要的作用［2－3］。目前國內(nèi)外報道的核苷磷酸化酶的產(chǎn)生菌主要有大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、乙酰短桿菌以及歐文桿菌等［4］，短乳桿菌產(chǎn)核苷磷酸化酶卻鮮有報道。

目前酶法合成核苷類物質的酶多數(shù)來源于野生菌株，基因工程菌盡管能有效提高酶產(chǎn)量，但構建步驟繁瑣，成本較高，僅有少量的報道。文獻調研表明，提高野生菌株產(chǎn)酶能力的方法主要集中在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化、傳統(tǒng)誘變育種及基因組重排等技術領域。大量的研究結果表明培養(yǎng)基優(yōu)化對菌體產(chǎn)酶量提高通常不明顯，傳統(tǒng)誘變技術具有盲目性和兩面性，誘變育種時間長等缺點。在原生質體融合技術基礎上發(fā)展起來的基因組重排技術不需預先掌握微生物的遺傳，只需在了解微生物遺傳性狀的基礎上實現(xiàn)對微生物的定向育種，此方法不但簡化了選育步驟，縮短了育種周期，而且為經(jīng)過多年誘變對理化誘變已不敏感的菌株提供新的改良方法，可以獲得大突變的菌株，因此它也成為發(fā)酵工程中的一種有效而安全的育種工具［5］。

原生質體制備和再生是基因組重排技術中非常重要的兩個環(huán)節(jié)［6］。目前關于高產(chǎn)核苷磷酸化酶菌株選育的報道很多，但通過基因組重排技術提高短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶的報道還未見。本實驗系統(tǒng)的對產(chǎn)胸苷磷酸化酶短乳桿菌的原生質體制備及再生條件進行優(yōu)化，并利用紫外－加熱滅活原生質體融合的方法獲得短乳桿菌融合子且對融合菌株的性質進行初步分析［7］，為進一步通過基因組重排技術選育高產(chǎn)胸苷磷酸化酶短乳桿菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

親本:短乳桿菌 E2A(菌體產(chǎn)量高)、短乳桿菌E2B(胸苷磷酸化酶活高)，微生物實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液

種子培養(yǎng)基(g/L):酵母膏10，雙蒸水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母膏10，葡萄糖20，NaCl 5，雙蒸水1 000 mL，pH 7.0 ～7.5。

普通固體培養(yǎng)基:在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上添加瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.5。

初篩培養(yǎng)基(g/L):酵母膏10，葡萄糖20，NaCl 5，K2HPO4·3H2O2，胸苷 20 mmol，雙蒸水 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

再生培養(yǎng)基:普通發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蔗糖0.5 mol/L，MgCl220 mmol/L，CaCl220 mmol/L，明膠 25 g/L，牛血清白蛋白(0.45 um微孔濾膜除菌)5 g/L，瓊脂20 g/L。均調 pH 6.5～7.0，以上培養(yǎng)基在115℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 試劑

滲透壓穩(wěn)定劑LPB(Tris-HCl 10 mmol/L，MgCl2·2H2O 20 mmol/L，蔗糖 0.5 mol/L)，pH 6.5，115℃滅菌15 min。

聚乙二醇(PEG 6000)購自國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 酶

溶菌酶(20 000 U/mg solid)，國藥集團化學試劑有限公司，用LPB配制，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌;變?nèi)芫?11 029 U/mg solid)，sigma公司，按照5000 U/mL溶解在0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中，pH 6.2，0.22 μm微孔過濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)與收集

從平板上挑取單菌落接種到種子發(fā)酵液中，37℃，110 r/min活化10～12 h，同樣發(fā)酵條件下，按照2%的接種量接入含有0.6%甘氨酸預處理的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心去上清液收集濕菌體備用。

1.2.2 原生質體的制備及再生

用含不同濃度甘氨酸的發(fā)酵液將短乳桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5 000 r/min離心15 min，棄上清液，然后用無菌生理鹽水和滲透壓穩(wěn)定劑LPB各洗滌1次，離心去除上清液，收集濕菌體。取菌懸液適當稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)測定菌濃，濕菌體用LPB懸浮保證菌濃在1～10×108CFU/mL，懸浮液中加入不同濃度的溶菌酶或變?nèi)芫兀?－9］，置于不同溫度恒溫水浴酶解一定時間，鏡檢觀察原生質體的形成情況。酶解后菌液3 000 r/min離心10 min收集原生質體，用滲透壓穩(wěn)定劑LPB洗滌1次，最后將原生質體懸浮于滲透壓穩(wěn)定劑LPB中。將菌懸液和原生質體液分別用無菌水和滲透壓穩(wěn)定劑梯度稀釋后涂布于普通固體培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24～36 h，測定短乳桿菌原生質體的制備率和再生率［10］。

式中:A為酶解前的總菌落數(shù);B為酶解后未脫壁菌體菌落數(shù);C為酶解后原生質體與未脫壁菌體的再生菌落數(shù)之和。

1.2.3 短乳桿菌原生質體UV－加熱滅活條件的確定

親本E2A和E2B原生質體液等比例混合，調整菌濃為108CFU/mL。取10 mL親本原生質體液于培養(yǎng)皿(φ90 mm)中，置于磁力攪拌器上，用20 W紫外燈距離20 cm照射，取不同照射時間的處理液涂布于再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，確定紫外致死時間。另取10 mL親本原生質體液于無菌離心管中，置于60℃水浴中熱滅活，取不同加熱時間的處理液涂布于再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，確定熱滅活時間。

1.2.4 原生質體融合

根據(jù)“致死損傷融合互補”原理［11－13］，將紫外滅活和熱滅活的原生質體等量混合，3 000 r/min離心10 min，去上清液，將原生質體重懸于0.5 mL滲透壓穩(wěn)定劑 LPB中，加入4.5 mL預熱至30℃的40%PEG 6000，充分混勻，于30℃水浴中恒溫融合10 min，再加入5 mL滲透壓穩(wěn)定劑LPB終止融合，隨即離心(3 500 r/min，5 min)洗滌1次，再用LPB適當稀釋后，取100 μL涂布于再生培養(yǎng)基上，37℃恒溫避光培養(yǎng)48 h篩選融合子。同時分別用紫外滅活和熱滅活的原生質體單獨融合做對照觀察融合情況。

1.2.5 短乳桿菌融合子初篩方法建立

將再生培養(yǎng)基上生長旺盛的融合子菌落分別接種到普通固體培養(yǎng)基和初篩培養(yǎng)基上，初篩培養(yǎng)基在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上添加底物胸苷和磷酸根，胸苷磷酸化酶為胞內(nèi)酶，短乳桿菌在生長的過程中，菌體可以利用體內(nèi)胸苷磷酸化酶催化發(fā)酵培養(yǎng)基中的胸苷和磷酸根生成胸腺嘧啶，胸腺嘧啶的生成使得發(fā)酵液在290 nm處吸光值增加，從而可粗略判斷菌體產(chǎn)胸苷磷酸化酶能力。將初篩培養(yǎng)液發(fā)酵10 h后分別用無菌水和pH 13的NaOH稀釋10倍和100倍測定其在600 nm和290 nm處吸光值。挑取OD600和OD290較高的融合菌體繼續(xù)進行胸苷磷酸化酶活測定。

他反反復復地練習滑翔，早早便成為了云浮“飛”得最遠的人。但那種借助外物機械帶來的飛行體驗，又怎能滿足得了他的心呢？他無數(shù)次地坐在山巔，仰望無盡的蒼穹，望著云浮山上空飛過的雄鷹和鴻雁，望著云浮山下飛過的雨燕和黃鸝，他無數(shù)次地想，如果能飛一次，哪怕只有一次，此生也便無憾事了。

1.2.6 胸苷磷酸化酶活測定

據(jù)Saunders等人報道［14］，采用紫外分光光度法測定反應生成的胸腺嘧啶來表征產(chǎn)酶量。標準酶反應混合液包含一定濃度的濕菌體，25 mmol/L的胸苷，1 mmol/L 的 EDTA，pH 7.3、50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖溶液。55℃條件下反應一段時間，反應結束后，反應液在沸水中煮沸5 min終止反應，離心去除沉淀。上清液用pH 12的NaOH稀釋100倍，然后測定290 nm的紫外吸光度OD290nm的增值［15］。胸苷磷酸化酶酶活單位定義為:在上述條件下，1 min內(nèi)OD290nm變化0.01所需的濕菌體量定義為短乳桿菌的1 個酶活力單位［4］。

式中:K為稀釋倍數(shù)(100);T為酶反應時間，min;M為濕菌體質量，mg。

2 結果與分析

2.1 短乳桿菌原生質體制備率和再生率［16］

2.1.1 短乳桿菌生長曲線

為了確定菌體的對數(shù)生長期，考察了短乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長過程。由圖1發(fā)現(xiàn)短乳桿菌生長速度較快，培養(yǎng)2 h時開始進入對數(shù)生長期，6 h后達到穩(wěn)定期。不同生長期菌體對溶菌酶的敏感程度有很大差別，處于對數(shù)生長后期的菌體細胞壁易被酶解形成原生質體，故選取培養(yǎng)5～6 h的菌體進行原生質體的制備。

圖1 短乳桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus brevis

2.1.2 甘氨酸濃度對短乳桿菌原生質體制備率及再生率的影響

酶解脫壁前添加甘氨酸可以改變細胞結構，使之發(fā)生松動增加其對溶菌酶的敏感性，由表1可以發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌對甘氨酸的敏感性隨著濃度的增加而增強，當甘氨酸濃度達到0.9%時，甘氨酸對菌體生長又明顯抑制作用，難以獲得原生質體，而低濃度的甘氨酸可以明顯提高原生質體制備率，對再生率的作用不大，故實驗中用含0.6%甘氨酸的發(fā)酵液培養(yǎng)菌體至對數(shù)生長期。

表1 甘氨酸對短乳桿菌原生質體制備率與再生率的影響Table 1 Effects of glycine on formation and regeneration rate of protoplast of Lactobacillus brevis

采用不同質量濃度的溶菌酶和變?nèi)芫?0℃恒溫酶解短乳桿菌，其原生質體的制備率和再生率隨著溶菌酶濃度的增加，逐漸增加，溶菌酶濃度為2 mg/mL時短乳桿菌原生質體制備率和再生率分別為74.1%和53.6%。當溶菌酶濃度為4 mg/mL時，原生質體制備率高達93.5%，但是再生率僅為22.5%，可能是過高濃度的溶菌酶，水解完細胞壁后，會繼續(xù)水解細胞膜上的部分蛋白質從而導致細胞死亡，致使原生質體不能再生。在2 mg/mL溶菌酶的基礎上添加不同濃度的變?nèi)芫兀Y果顯示變?nèi)芫貙Χ倘闂U菌作用不明顯。因此綜合考慮原生質體制備率和再生率，使用2 mg/mL溶菌酶酶解短乳桿菌制備原生質體。

圖2 不同酶種類及其質量濃度對短乳桿菌原生質體制備率及再生率的影響Fig.2 Effects of types and concentration of enzymes on formation and regeneration rate of protoplast of Lactobacillus brevis

2.1.4 酶解溫度對原生質體制備率和再生率的影響酶解溫度可以直接影響到酶促反應速率和原生質體化程度。本實驗分別設置30、37、40、45℃ 4個溫度梯度，在2 mg/mL溶菌酶酶解90 min條件下進行試驗，考察酶解溫度對原生質體制備率和再生率的影響，結果見圖3。原生質體制備率隨溫度升高而升高，但原生質體再生率在37℃時出現(xiàn)拐點，達到最大值56.0%。因此本研究選用37℃作為短乳桿菌制備原生質體的最佳酶解溫度。

2.1.5 酶解時間對短乳桿菌原生質體制備率和再生率的影響

圖3 酶解溫度對短乳桿菌原生質體制備率及再生率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis temperature on formation and regeneration rate of protoplast of Lactobacillus brevis

將短乳桿菌培養(yǎng)6 h至對數(shù)生長后期，2 mg/mL溶菌酶在37℃恒溫酶解不同時間，結果如圖4。原生質體制備率隨著酶解時間的延長而升高，酶解2 h時，原生質體的制備率達到95%，再生率達到48%，若繼續(xù)延長酶解時間，原生質體制備率可達到100%，但再生率大大降低，故最佳酶解時間為2 h。

圖4 酶解時間對短乳桿菌原生質體制備率及再生率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time on formation andregeneration rate of protoplast of Lactobacillus brevis

2.2 短乳桿菌原生質體UV-加熱滅活時間確定

2.2.1 短乳桿菌原生質體的紫外滅活

由表2可知，使用20 W紫外線距離20 cm照射50 min，短乳桿菌原生質體(包括未酶解的菌體)幾乎完全滅活，只有約6.2×10－7的低存活率。因此，短乳桿菌原生質體紫外滅活條件為:紫外燈功率20 W，距離20 cm，照射時間為50 min。

表2 短乳桿菌原生質體紫外滅活時間對滅活率的影響Table 2 Effect of UV inactivated time on inactivation rate of Lactobacillus brevis protoplast

2.2.2 短乳桿菌原生質體的熱滅活

由于熱滅活的原發(fā)作用主要在細胞質中，故加熱溫度不能過高，本研究在60℃條件下對短乳桿菌原生質體加熱不同時間以確定其完全致死加熱時間。由表2可知，原生質體在60℃水浴中加熱60 min，存活率僅為3.2×10－7，故熱滅活條件為:60℃水浴加熱60 min。

表3 短乳桿菌原生質體熱滅活時間對滅活率的影響Table 3 Effect of heating inactivated time on inactivation rate of Lactobacillus brevis protoplast

2.3 融合子的篩選

紫外使細胞致死的原發(fā)作用點主要在DNA上，熱滅活的原發(fā)作用主要在細胞質中，雙親滅活原生質體融合后獲得重組體的機制是細胞致死率損傷經(jīng)過融合得以互補的結果，使用雙親滅活融合獲得重組子可以減少對親株的遺傳標記工作，使融合子的檢出變得直觀，提高篩選融合子的效率［11］。分別以紫外滅活和加熱滅活的原生質體單獨做融合觀察雙親滅活原生質體融合情況。

2.3.1 融合子初篩

前期試驗發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L胸苷和2 g/L磷酸根對短乳桿菌菌體生長影響不顯著，短乳桿菌可以直接利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的胸苷和磷酸根在其胸苷磷酸化酶的作用下生成胸腺嘧啶，從而使發(fā)酵液在290 nm出的吸光值增加，圖5為融合子初篩結果，短乳桿菌原生質體經(jīng)過融合后菌體產(chǎn)量和酶活都稍有提高，融合子F15、F16、F17產(chǎn)菌體量和酶活提高較其他融合子顯著，故對這3株融合子繼續(xù)進行酶活測定及菌株穩(wěn)定性測試。

圖5 融合子菌體生長及胸苷磷酸化酶活初篩試驗結果Fig.5 Results of cell growth and thymidine phosphorylase for the fusant

2.3.2 融合子F15、F16、F17酶活測定及遺傳穩(wěn)定性測定

初篩挑選出的融合菌株F15、F16、F17分別測試其菌體發(fā)酵量和胸苷磷酸化酶活，以親本E2A和E2B為對照，測試結果如表4。從表4可以看到，融合子菌體發(fā)較量和胸苷磷酸化酶活均有提高，其中F15酶活提高50%，達到1.538 U/mg濕菌體，菌體發(fā)較量也略有提高，對融合子F15五次傳代后，改菌株產(chǎn)胸苷磷酸化酶活穩(wěn)定在1.500 U/mg濕菌體左右。

表4 產(chǎn)胸苷磷酸化酶親本E2A、E2B和融合菌株的酶活性能比較Table 4 Comparison of thymidine phosphorylase for parent strains E2A，E2B and fusants

3 結論

3.1 原生質體的制備與再生

合適的菌齡、菌體濃度及酶解條件是原生質體制備與再生成功的前提條件［17］。對數(shù)期的菌體生理狀態(tài)一致，代謝旺盛，菌體活性高，對酶的敏感性強，故易于原生質體化與再生;不同種屬的微生物在制備原生質體時所需的酶種類和濃度不同。本實驗發(fā)現(xiàn)短乳桿菌對變?nèi)芫夭幻舾?，對溶菌酶較敏感，2 mg/mL的溶菌酶有利于短乳桿菌原生質體的制備與再生;酶解溫度可以直接影響到酶促反應速率和原生質體化程度，實驗發(fā)現(xiàn)溶菌酶酶解短乳桿菌細胞壁的最適酶解溫度為37℃;酶解時間對原生質體的形成和再生起著重要作用，酶解時間太短，細胞壁脫壁不完全，易再生，但原生質體形成率低，酶解時間過長，脫壁完全，原生質膜易被酶液破壞，原生質體再生率低，不利于融合子的形成，綜合以上影響因素確定短乳桿菌原生質體制備與再生的較佳條件為:菌體發(fā)酵至對數(shù)生長中后期，調整菌濃為108CFU/mL時，用2 mg/mL溶菌酶在37℃恒溫水浴中酶解2 h，此時原生質體的制備率和再生率分別達到95%和48%左右，有利于后續(xù)原生質體融合及基因組重排等技術開展［18］。

3.2 短乳桿菌原生質體融合及融合子性質

與傳統(tǒng)誘變相比，原生質體融合具有集中雙親本優(yōu)良性狀的優(yōu)勢，原生質體選育優(yōu)良性狀融合菌株的方法已有很多研究。工業(yè)微生物雜交育種必須對親株進行遺傳標記，本研究利用雙親滅活的方法對原生質體進行融合，可以省去親本遺傳標記這步繁瑣的工作。文獻資料顯示，雙親皆用UV滅活仍有一定的重組率，皆用熱滅活時，重組率為零。根據(jù)“致死損傷融合互補”原理，對親本原生質體分別進行UV滅活50 min，熱滅活60 min，用40%化學融合劑PEG 6000在30℃水浴中融合10 min，挑取再生培養(yǎng)基上的融合子進行初篩和復篩，融合菌株的菌體發(fā)酵量和產(chǎn)胸苷磷酸化酶的能力均有提高，融合子F15的酶活達到1.538 U/mg濕菌體，經(jīng)過5次傳代后進行酶活測試，酶活均維持在1.500 U/mg濕菌體，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

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