張國榮 臺桂香 張淑芳 池明 方軍

肌腱損傷修復是目前的研究熱點之一。有研究發(fā)現(xiàn)某些細胞因子和細胞外基質(zhì)能夠影響肌腱的修復過程[1-3]。為了研究這些因子的作用，通常采用分子生物學技術(shù)提高或降低基因的表達，檢測損傷肌腱修復效果的變化。研究中采用的模型有細胞模型和動物模型[4-5]。細胞模型便于應用基因調(diào)控手段導入目的基因或抑制相關(guān)基因的表達，并能夠從基因、蛋白水平檢測細胞的生物學變化，但是無法像肌腱組織一樣觀察膠原纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)。動物模型便于觀察組織結(jié)構(gòu)，可以進行形態(tài)學研究，但是在進行基因手段干預過程中，需要構(gòu)建病毒載體，實驗周期較長，程序復雜，而且體內(nèi)實驗的影響因素也較多。所以本實驗探索構(gòu)建一種既方便用于基因調(diào)控手段干預，又能夠進行形態(tài)學檢測的組織工程肌腱，用于肌腱損傷修復的體外研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、混合膠原酶，維生素C、甲醛、石蠟、無水乙醇、二甲苯、HE染液、Masson三色染液、戊二醛、鋨酸、透射電鏡組織包埋劑。

1.1.2 儀器 細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡（Olympus）、組織包埋機、切片機、透射電子顯微鏡（Quanta 10 FEI）。

1.1.3 實驗動物 Sprague-Dawley （SD）大鼠，雌雄不限，體重250 g左右。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)肌腱細胞 取大鼠跟腱，剝離肌腱腱膜，將組織塊剪成勻漿狀，用混合膠原酶消化后，加入含10%FBS的DMEM，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下進行原代培養(yǎng)。3 d更換一次培養(yǎng)基。當細胞鋪滿培養(yǎng)皿底約90%時，用胰蛋白酶消化按1：3進行傳代培養(yǎng)。取P5以內(nèi)的細胞用于實驗。

1.2.2 構(gòu)建組織工程肌腱 用高糖DMEM培養(yǎng)肌腱細胞，培養(yǎng)基中加入10% FBS和50 μg/ml維生素C，防止細胞老化和促進細胞外基質(zhì)分泌。3 d更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩周后細胞外基質(zhì)逐漸累積與細胞共同在培養(yǎng)皿底部形成連續(xù)的細胞片。用移液槍頭尖部沿培養(yǎng)皿邊緣慢慢卷起細胞片，形成長條形組織。繼續(xù)培養(yǎng)一周，使細胞片光滑面與粗糙面充分融合形成組織工程肌腱。

1.2.3 檢測組織工程肌腱的光鏡結(jié)構(gòu) 為了檢測組織工程肌腱中細胞的生存狀態(tài)和膠原纖維的形態(tài)特點，采用石蠟切片法制作組織學切片，分別用HE染色法和Masson三色染色法進行處理，在光學顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 檢測組織工程肌腱的電鏡結(jié)構(gòu) 為了檢測組織工程肌腱中膠原纖維的排列狀態(tài)和直徑大小，用戊二醛和鋨酸雙重固定標本，組織包埋劑包埋，制作超薄切片，在電子顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建無支架的組織工程肌腱 圖1A示體外培養(yǎng)的大鼠肌腱細胞，細胞生存狀態(tài)良好。圖1B示構(gòu)建的組織工程肌腱，它不含任何支架材料，完全由肌腱細胞和細胞外基質(zhì)構(gòu)成，表面光滑，結(jié)構(gòu)緊密。

圖1 體外培養(yǎng)大鼠肌腱細胞和構(gòu)建的組織工程肌腱

2.2 組織工程肌腱的光鏡結(jié)構(gòu) 在光學顯微鏡下，HE染色的組織工程肌腱（圖2A）顯示肌腱細胞生存良好，散在分布，細胞外基質(zhì)分泌豐富。Masson三色染色（圖2B）顯示組織工程肌腱內(nèi)形成了連續(xù)的呈波浪式的膠原纖維。

圖2 組織工程肌腱的光鏡結(jié)構(gòu)

2.3 組織工程肌腱的電鏡結(jié)構(gòu) 在透射電子顯微鏡下，膠原纖維橫切處（圖3A）可見膠原纖維直徑大小相對均一，與正常肌腱組織中含有粗細不等的膠原纖維不同。膠原纖維縱切處（圖3B）顯示膠原纖維排列整齊，有明暗交替的周期性橫紋。

圖3 組織工程肌腱的電鏡結(jié)構(gòu)

3 討論

本研究由體外培養(yǎng)的大鼠肌腱細胞成功構(gòu)建了組織工程肌腱。該肌腱完全由肌腱細胞和細胞外基質(zhì)構(gòu)成，不含任何支架材料。所以在檢測相關(guān)生物學指標時干擾因素較少。同時，它可以方便地應用RNAi、antisense等基因調(diào)控手段。該肌腱中細胞生存良好，細胞外基質(zhì)分泌豐富，具有連續(xù)的呈波浪式的膠原纖維?？梢杂糜跈z測肌腱細胞基因調(diào)控后膠原合成能力的變化，觀察膠原纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而分析肌腱細胞中某些因子或細胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)作用，為肌腱損傷修復帶來有用的生物學信息。電鏡結(jié)構(gòu)顯示，該肌腱中膠原纖維排列整齊，直徑大小相對均一，與損傷肌腱組織類似[6-7]，是一種良好的肌腱損傷模型，適用于肌腱損傷的體外研究。當然，這種無支架純細胞的組織工程肌腱在力學性能上會次于有支架的組織工程肌腱[8-9]。本實驗構(gòu)建的組織工程肌腱并不是用于治療肌腱損傷的功能性肌腱[10]，而是旨在為體外檢測損傷肌腱的生物學指標提供方法手段，尤其是在基因手段研究某些因子對肌腱損傷修復的影響時具有顯著的優(yōu)勢。

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