詹 鵬，徐萬吉，陳介南*，張 林，譚亦文，石 旺

(1.國家林業(yè)局生物乙醇研究中心， 湖南 長沙 410004； 2.中南林業(yè)科技大學(xué)生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所， 湖南 長沙 410004； 3. 湖南小溪國家級自然保護(hù)區(qū)管理局， 湖南 永順 416709)

小溪國家級自然保護(hù)區(qū)落葉木蓮生長與遺傳多樣性分析

詹 鵬1,2，徐萬吉3，陳介南1,2*，張 林1,2，譚亦文1,2，石 旺1,2

(1.國家林業(yè)局生物乙醇研究中心， 湖南 長沙 410004； 2.中南林業(yè)科技大學(xué)生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所， 湖南 長沙 410004； 3. 湖南小溪國家級自然保護(hù)區(qū)管理局， 湖南 永順 416709)

對小溪國家級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)落葉木蓮生長特性進(jìn)行了調(diào)查，并采用RAPD-PCR分子生物學(xué)技術(shù)分析落葉木蓮的遺傳多樣性。結(jié)果表明：該保護(hù)區(qū)內(nèi)落葉木蓮的胸徑-樹高生長曲線為Y=-0.0043X2+0.731X+0.7837；從UPGMA聚類基因圖譜分析得出該區(qū)內(nèi)落葉木蓮具有遺傳親緣關(guān)系，推斷該區(qū)內(nèi)落葉木蓮具有相近的起源，為研究該區(qū)內(nèi)落葉木蓮的起源及保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)。

落葉木蓮；生長曲線；遺傳多樣性；小溪國家級自然保護(hù)區(qū)

落葉木蓮(Manglietiadeciduas)又名華木蓮，是我國特有單種屬，1999年被列入《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第一批)》。由于其落葉的固有特性，落葉木蓮為木蘭科的木蓮屬與木蘭屬間的親緣關(guān)系找到了一條紐帶，對研究木蘭科的系統(tǒng)演化，乃至探討被子植物的起源，有著極其重要的地位[1]。另外，落葉木蓮具有較高的觀賞價(jià)值，可作為優(yōu)美的庭園綠化樹種、營造速生豐產(chǎn)林的樹種和上等的建筑、家具、細(xì)木工等的用材樹種。

2003年，小溪國家級自然保護(hù)區(qū)管理站在其核心區(qū)魯家村收集植物資源種子時(shí)發(fā)現(xiàn)一種木蓮屬的種子，經(jīng)有關(guān)專家實(shí)地考察，經(jīng)鑒定該物種為落葉木蓮。同年，在與魯家村接壤的云盤村也發(fā)現(xiàn)了該樹種，至此，打破了落葉木蓮僅發(fā)布于江西幕阜山地宜春市明月山的報(bào)道[2-3]，使得落葉木蓮成為湖南省擁有的珍稀國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物。由于落葉木蓮自身遺傳多樣性較差，其繁衍能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它林木，使得落葉木蓮種群數(shù)量稀少[4-5]，同時(shí)受群落內(nèi)其他物種的競爭作用，加劇了落葉木蓮的瀕危程度[6]，對落葉木蓮的調(diào)查及保護(hù)顯得尤其重要。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(Random amplified poIymorphic DNA，RAPD)分子標(biāo)記技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)之上檢測受試材料基因組的遺傳變異關(guān)系的一種分子生物學(xué)技術(shù)，由于其簡便快捷、多態(tài)性高、成本低等特點(diǎn)，已在植物研究中獲得了廣泛應(yīng)用，如進(jìn)行植物遺傳圖譜的建立，植物系統(tǒng)分類學(xué)及種質(zhì)資源遺傳關(guān)系的研究，輔助選擇育種等[7]。我們對小溪國家級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)落葉木蓮的分布及生長特性進(jìn)行了調(diào)查，并采用RAPD-PCR分子生物學(xué)技術(shù)揭示種間的親緣關(guān)系，為保護(hù)這一珍稀瀕危物種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)地概況

小溪國家級自然保護(hù)區(qū)位于湖南省西北部湘西自治州永順縣境內(nèi)，地理坐標(biāo)為：110°06′50″—110°21′35″E，28°42′15″—28°53′15″N。東西長23.5km，南北寬20km，總面積24800hm2，系亞熱帶保存最完整、面積最大的低海拔常綠闊葉原始次生林區(qū)之一，是少數(shù)免遭第四紀(jì)冰川侵襲而幸存的天然資源寶庫之一。境內(nèi)最高海拔1327.1m，最低海拔162.6m，海拔高度差達(dá)1164.5m。保護(hù)區(qū)屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均氣溫12～14℃，無霜期海拔較低處為250d，800m以上為200d。年降水量1300～1400mm。土壤為板頁巖發(fā)育的山地黃紅壤，較肥沃，pH 值平均為 6.0。采樣地位于小溪國家級自然保護(hù)區(qū)核心區(qū)魯家村低塔，東經(jīng)110°15′46.42″—110°15′48.56″，北緯28°51′47.00″—28°51′51.51″，海拔679～752m，總面積10000m2。

保護(hù)區(qū)內(nèi)最大株落葉木蓮位于魯家村低塔，胸徑70cm，樹高31.2m，冠幅13m×12m，枝下高6m，主干高2m處已空腐，樹齡約300a，年可采落葉木蓮果實(shí)約20kg。該樹10m×10m內(nèi)土壤為山地黃紅壤，pH 值為5.8，地表10cm處土壤密度為1.613g/cm3，有機(jī)碳質(zhì)量為8.34g/kg，分布有宜昌潤楠、甜櫧、楊桐、錐栗、赤皮青岡、楓香、多青岡、線葉蕗蕨、鐘鄂木(國家一級保護(hù)樹種)、波葉木巴戟、尖連蕊茶、銀木荷等物種。該樹超過江西省宜春市明月山國家森林公園發(fā)現(xiàn)的樹高30m、胸徑63cm、冠幅7m×4m落葉木蓮最大株的記錄[1]。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1 試驗(yàn)材料 落葉木蓮樹葉采自小溪國家級自然保護(hù)區(qū)核心區(qū)魯家村，采集株數(shù)4株，置于封口袋內(nèi)冰盒保鮮送至實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆?。樣品情況詳見表1。

表1 落葉木蓮樣品基本情況Tab1 BasicsituationofdifferentManglietiadeciduassamples編號胸徑(cm)樹高(m)經(jīng)緯度海拔(m)經(jīng)度緯度128158110°15′4856″28°51′4700″7522635110°15′4757″28°51′4919″706370312110°15′4605″28°51′5138″71241080110°15′4642″28°51′5151″679

2.1.2 試驗(yàn)試劑及引物 試驗(yàn)所需試劑均為市售分析純。擴(kuò)增所需引物由上海寶生生物科技有限責(zé)任公司設(shè)計(jì)合成(見表2)。

表2 引物序列Tab2 Sequenceofprimers序號引物名稱引物序列 GC含量(%)1S365’AGCCAGCGAA3’602S375’GACCGCTTGT3’603S435’GTCGCCGTCA3’704S1345’TGCTGCAGGT3’605S1475’AGATGCAGCC3’606S3875’AGGCGGGAAC3’707S4045’GGCGGCTGTC3’808S4055’GGGAACGTGT3’60

2.2方法

2.2.1 生長曲線的測定 于2012年7月中旬進(jìn)入保護(hù)區(qū)魯家村進(jìn)行落葉木蓮的實(shí)地測定。其中樹高采用測樹儀法；胸徑采用測樹圍尺法；經(jīng)緯度采用GPS儀測定法。

2.2.2 遺傳多樣性分析

(1) DNA提取與檢測。落葉木蓮總DNA的提取采用如下方法[8]: ①去離子水將落葉木蓮葉片洗凈，滅菌后的吸水紙吸去表面的水分；②取0.2～ 0.3g 剪碎，加液氮迅速在研缽中研磨至粉狀，加1.5 mL 65℃預(yù)熱的CTAB 提取液；③分裝至1.5 mL離心管中，65℃水浴60min；④加0.5 mL氯仿/異戊醇(24∶1，V/V)，混勻，8000r/min離心10min，取上清液，重復(fù)2次；⑤加2/3體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，10000r/min離心10min，棄上清，70%乙醇洗滌沉淀；⑥干燥后50μL TE 緩沖液溶解沉淀，并加入2 μL 10mg/mL的RNAse室溫放置30min，4℃保存?zhèn)溆谩?.8%瓊脂糖凝膠電泳，Syngene Genesnap凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

(2) RAPD-RCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：25μL總體積，2.5μL PCR Buffer，0.2mMdNTP， 2.8 mM MgCl2，0.3 μM引物，2.5 U Taq DNA，100 ng DNA 模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，然后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中94℃變性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。反應(yīng)在MJ PTC-200基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，Syngene Genesnap自動凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

3 結(jié)果與分析

3.1落葉木蓮生長曲線

調(diào)查區(qū)域內(nèi)落葉木蓮胸徑最小、最大值分別為6cm和70cm，樹高最小、最大值分別為3.5m和31.2m，胸徑在15cm以下的樣本占總數(shù)(4株)的66.7%。通過Excel軟件進(jìn)行擬合，調(diào)查區(qū)域內(nèi)落葉木蓮胸徑與樹高存在著一定的相關(guān)性(R2=0.9693)，其公式為：Y=-0.0043X2+0.731X+0.7837，其中Y代表樹高(m)，X代表胸徑(cm)(見圖1)。

圖1 落葉木蓮胸徑-樹高曲線Fig.1 Relationship between DBH and height of Manglietia deciduas

3.2RAPD-PCR檢測

3.2.1 DNA質(zhì)量檢測 環(huán)境樣品能否順利提取基因組總DNA片段是能否進(jìn)行RAPD-PCR技術(shù)分析的前提。所提取的DNA 樣品的色澤為白色或近白色，采用核酸和蛋白質(zhì)含量測定儀(GeneQuant Pro)檢測 260nm、 280nm波長處的光吸收比值 OD260/ OD280為 1.75， 計(jì)算可知 DNA 產(chǎn)率為0.314ug/L，DNA 瓊脂糖電泳圖譜如圖2所示。由圖2可看出，各落葉木蓮樣品基因組 DNA 電泳得到的條帶可進(jìn)行后續(xù)RAPD-PCR分析。

圖2 落葉木蓮總DNA電泳檢測Fig.2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of different samples

3.2.2 RAPD-PCR擴(kuò)增 如表3所示，由于落葉木蓮的遺傳多樣性較差，采用8種單引物對各落葉木蓮DNA樣品進(jìn)行RAPD擴(kuò)增所得圖譜中的條帶較少(0～4條)。通過比選擴(kuò)增出條帶的多少，選擇引物S404(5’GGCGGCTGTC3’)為進(jìn)行RAPD擴(kuò)增的最優(yōu)引物，并采用該引物對各落葉木蓮樣品進(jìn)行擴(kuò)增，以揭示各樣本之間的親緣關(guān)系。由圖3可知，各樣品均擴(kuò)增出3至4個(gè)條帶。1、3號樣有3條條帶，2、4號樣有4條條帶。

表3 引物擴(kuò)增結(jié)果Tab3 Resultsoftheprimersamplification序號引物名稱引物序列GC含量(%)條帶數(shù)1S365’AGCCAGCGAA3’6012S375’GACCGCTTGT3’6043S435’GTCGCCGTCA3’7024S1345’TGCTGCAGGT3’6005S1475’AGATGCAGCC3’6026S3875’AGGCGGGAAC3’7007S4045’GGCGGCTGTC3’8018S4055’GGGAACGTGT3’603

圖3 落葉木蓮RAPD-PCR電泳檢測Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RAPD-PCR products

3.3聚類分析

通過DPS軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析(見圖4)，4個(gè)樣品可分為2類，其中1、3號樣分為1類，2、4號樣分為1類，結(jié)合表1各落葉木蓮的生長地域可推測1、3號落葉木蓮可能是2、4號落葉木蓮的后代，4株落葉木蓮存在著親緣關(guān)系。

圖4 落葉木蓮RAPD 的UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA cluster analysis of different samples

4 結(jié)論與討論

通過實(shí)地測量確定了小溪國家級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)落葉木蓮的胸徑-樹高生長曲線為Y=-0.0043X2+0.731X+0.7837，其中該區(qū)內(nèi)最大株落葉木蓮是迄今為止已有報(bào)道的最大株落葉木蓮。通過RAPD-PCR分子生物學(xué)技術(shù)分析落葉木蓮DNA，得出該區(qū)內(nèi)落葉木蓮具有遺傳親緣關(guān)系，為落葉木蓮的起源研究及保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù) 。

[1] 鄭慶衍, 鄭峻嶸.新發(fā)現(xiàn)的瀕危樹種——落葉木蓮[J].植物雜志,2000(1):1.

[2] 易宏, 侯伯鑫, 陳家法, 等. 永順縣落葉木蓮花的形態(tài)學(xué)研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版. 2006,32(6):611-615.

[3] 侯伯鑫, 林峰, 田學(xué)洲, 等. 湖南永順縣落葉木蓮資源考察研究[J].中國野生植物資源,2007,26(2):18-22.

[4] 廖文芳, 夏念和, 鄧云飛,等.華木蓮的遺傳多樣性研究[J].云南植物研究.2004,26(1):58-64.

[5] Hamrick JL, Godt MJW. Allozyme diversity in plant species[M]//Brown AHD, Clegg MT, Kahler AL, et al. Plant population genetics, breeding, and genetic resources.Sunderland, Mass:Sinauer Associates,1990:43-63.

[6] 袁斌榮. 落葉木蓮的瀕危機(jī)理與保護(hù)對策[J].江西林業(yè)科技,2005(3):45-46.

[7] 胡裕清, 趙樹進(jìn).RAPD技術(shù)及其在植物研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào),2010(5):74-77.

[8] 鄒喻蘋, 葛頌, 王曉東.系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2001.

(文字編校：張 珉)

AnalysisofgrowthandgeneticdiversityofManglietiadeciduasinXiaoxiNationalNatureReserve

ZHAN Peng1,2, XU Wanji3, CHEN Jienan1,2*, ZHANG Lin1,2,TAN Yiwen1,2, SHI Wang1,2

(1. State Bureau of Forestry, Bioethanol Research Center, Changsha 410004, China; 2. Institute of Biological and Environmental Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 3. Administration of Xiaoxi National Nature Reserve, Yongshun 416709, China)

The growth characteristic ofManglietiadeciduasin Xiaoxi National Nature Reserve was investigated, and the RAPD-PCR molecular biology technique and UPGMA cluster method were used to analyze the genetic diversity ofManglietiadeciduas. The results showed that, the DBH-height growth curve ofManglietiadeciduaswas fitted with a formula, which wasY=-0.004 3X2+0.731X+0.783 7. There were some genetic relationship and the similar origin among differentManglietiadeciduasplants in the survey area, which provided the scientific basis for the origin and protection ofManglietiadeciduasin Xiaoxi National Nature Reserve.

Manglietiadeciduas; growth curve; genetic diversity; Xiaoxi National Nature Reserve

2012-10-12

2013-01-11

國家林業(yè)局野生植物保護(hù)管理項(xiàng)目(090630)。

詹 鵬(1982-)，男，湖南省保靖縣人，講師，主要從事環(huán)境生物技術(shù)研究。

* 為通迅作者

Q 943

A

1003-5710(2013)01-0057-04

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2013. 01. 016