熊力夫， 鄒親朋， 葉惠煊， 劉向前

(1.長沙市葛根工程技術研究中心, 湖南 長沙 410005； 2.長沙博海生物科技有限公司， 湖南 長沙 410205； 3.湖南中醫(yī)藥大學， 湖南 長沙 410208)

湘葛一號葛根活性物質提取制備葛根功能飲品研究

熊力夫1， 鄒親朋2， 葉惠煊3， 劉向前3

(1.長沙市葛根工程技術研究中心, 湖南 長沙 410005； 2.長沙博海生物科技有限公司， 湖南 長沙 410205； 3.湖南中醫(yī)藥大學， 湖南 長沙 410208)

以葛根為原料，以葛根素為主要評價指標，研究了葛根中各主要活性成分的含量、葛根黃酮的制備、葛根黃酮飲品的穩(wěn)定性及極端條件的破壞性、葛根黃酮飲品口感及感官指標、葛根黃酮飲品生產工藝等。結果表明：與泰國葛根、粉葛等相比，湘葛一號葛根中葛根素等活性成分含量明顯較高。不同濃度乙醇提取葛根總黃酮，以65%乙醇提取效果最好。湘葛一號天然葛根飲品的制備過程中，低濃度(21.6mg/500mL)、中濃度(216mg/500mL)飲品在不同溫度條件下的葛根黃酮均無明顯變化，含量穩(wěn)定；高濃度(360mg/500mL)飲品葛根黃酮含量均有不同程度減少，穩(wěn)定性稍差；中、高濃度飲品葛根黃酮高溫易氧化變色，低溫易沉淀析出，故低濃度飲品穩(wěn)定性最佳。在各濃度葛根飲品中，每500mL含葛根素100mg及以下的葛根飲品顏色透明清亮；每500mL含葛根素2.16mg等低濃度的飲品與純凈水無明顯口感差異，21.6mg級別的飲品口感微苦，并有一種清涼感，適合飲用。

葛根； 黃酮； 生產工藝； 功能飲品

葛根(Puerarialobata)是一種藥食兩用的經(jīng)濟作物，具有極高的營養(yǎng)價值和醫(yī)藥價值，在我國素有“南葛北參”的美譽。葛根為豆科植物湘葛一號 的干燥根，習稱湘葛一號。葛根在世界上共有20個品種，中國有12種，種質資源居世界首位。近年來，國內外醫(yī)學專家對葛根的深入研究表明，異黃酮類化合物是葛根的主要有效活性成分，其中包括大豆甙元、大豆甙、葛根素、大豆素4，7-二葡萄糖甙等，其中葛根素是本屬的主要成分及特有成分[1-4]。葛根異黃酮類化合物具有促進心腦血管血液流動、舒張平滑肌角痙、抗癌及誘導癌細胞分化、抗氧化、降血糖、降血脂以及增強機體免疫等作用[5-8]。

我國已生產出以葛根及其提取物為原料的一系列藥品，主要制劑有：葛根片、葛根黃酮片、愈風寧心片、葛根素注射液、葛根黃豆甙片等[9-11]。在國際市場上，日本、韓國、泰國及歐美等國每年從中國進口大量的葛根粉，制成葛凍，或加入牛奶制成流質食品、飲料等功能飲食和風味食品，此外在醫(yī)藥和化工領域也被廣泛使用。但在國內，葛根資源的開發(fā)利用還處于起步階段，深度和廣度不夠，沒有形成系列的深加工產品。我們以葛根為原料，以葛根素為活性成分和主要評價指標，開發(fā)出功能型解渴、保健的湘葛一號天然葛根飲品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

湘葛一號葛根、泰國葛根、粉葛、葛根莖葉。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同品種葛根中各主要活性成分的含量

(1) 水溶性葛根黃酮制備原料的選擇: 采用HPLC，以甲醇-水梯度洗脫，以葛根素為主要考察指標，輔助以大豆苷元、大豆苷、染料木素為參考指標，比較各品種中有效成分的含量。

(2) 水溶性葛根黃酮標準品溶液的制備：精密稱取葛根素對照品3.53mg，甲醇溶解定容至50mL，微孔濾膜過濾，即得。

(3) 水溶性葛根黃酮樣品溶液的制備：分別取泰國葛根、粉葛、湘葛一號、葛根莖葉樣品粉末0.1g于錐形瓶中，加30%乙醇50mL，稱定重量，于水浴鍋中回流30min，補足失重，微孔濾膜過濾，即得。

(4) 色譜條件: 儀器: SHIMADZU SPD — 10A；波長250nm；規(guī)格: 柱長150mm，內徑4.6mm，粒徑5μm;柱溫25℃；流速0.8mL/min；流動相: 甲醇 — 水；進樣量10μL；梯度洗脫程序見表1。

1.2.2 不同濃度乙醇對葛根總黃酮提取率的影響 取葛根(湘葛一號，下同)粉末3份，每份10g，分別用65%乙醇、30%乙醇、水提取2次，每次8倍量溶劑提取2h，合并2次提取液，分別得提取液130mL、140mL和143mL。以葛根素為考察指標，采用HPLC測定其含量，通過測定結果比較不同濃度乙醇對葛根總黃酮提取率的差異。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Thegradientprogram時間(min)MeOH(%)H2O(%)0208010257515406018～20465422554525653530722835～402080

HPLC測定方法采用《中華人民共和國藥典》2010版葛根中葛根素的檢測方法。具體方法如下：

(1) 標準品溶液的制備：精密稱取葛根素對照品3.53mg，甲醇溶解定容至50mL，微孔濾膜過濾，即得。

(2) 原料樣品的制備：取葛根粉末0.1003g于錐形瓶中，加30%乙醇50mL，稱定重量，于水浴鍋中回流30min，補足失重，微孔濾膜過濾，即得。

(3) 葛根不同濃度醇提取物樣品的制備：分別取水、30%乙醇、65%乙醇提取液2mL于50mL容量瓶中，加30%乙醇溶解，定容，微孔濾膜過濾，即得。

(4) 色譜條件： 儀器: SHIMADZU SPD-10A；波長250nm；規(guī)格: 柱長150mm，內徑4.6mm，粒徑5μm；柱溫25℃；流速0.8mL/min；流動相: 甲醇 — 水(25∶75)；進樣量 10μL。

1.2.3 水溶性葛根黃酮的制備(提取及純化)[12-15] 采用65%乙醇提取葛根總黃酮，將葛根藥材粉碎，過80目篩，通過正交設計實驗，采用3因素3水平正交表格，考察浸泡時間、提取溶劑用量、提取時間對提取率的影響，確定加熱前浸泡1h，采用10倍量溶劑分別提取1.5h、1h，提取2次，可以獲得很好的提取效果。所得提取液可經(jīng)吸附法精制，初步確定出最佳工藝是用D101大孔吸附樹脂作為富集劑,用粗提浸膏8倍量的大孔樹脂吸附,用15倍量的體積分數(shù)70%乙醇水溶液作為洗脫劑,可以較完全地將葛根素洗脫下來。經(jīng)聚酰胺柱層析,以水洗脫、 濃縮、 放置析出葛根素粗品，含量可達80%左右。粗品再次經(jīng)聚酰胺柱層析、 水洗脫、 濃縮析出結晶 ,再經(jīng)冷凍干燥、噴霧干燥或用體積分數(shù)75%左右乙醇重復結晶制得精品,其葛根素含量可達90%以上。

1.2.4 葛根黃酮溶解性試驗 擬先對葛根素在水中的溶解度進行研究，采用80%含量葛根素，過量加入水中，超聲溶解分散，形成過飽和的葛根素水溶液，發(fā)現(xiàn)溶液渾濁，有絮狀，離心除去未溶解的葛根素，HPLC測得葛根素在水中的溶解度約為4.6g/L。

以此為基礎，分別取葛根素約200mg于10 mL具塞標準口試管中，再于每支試管中加入不同量的不同種類氨基酸、苯甲酸鈉等助溶劑，以移液管準確加入10mL蒸餾水，用玻璃棒充分研磨并振搖后，置超聲清洗器中振蕩，10min后取出離心15min,上清液用微孔濾膜過濾后，取1mL置50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，采用《中華人民共和國藥典》2010版葛根中葛根素的檢測方法HPLC測定其含量，每組試驗重復測定3次，取其均值。

1.2.5 葛根黃酮飲品穩(wěn)定性試驗及加速破壞性試驗 根據(jù)《中華人民共和國藥典》2010版中葛根和粉葛的推薦使用量和規(guī)定的含量要求，配制了每500mL含葛根素2.16mg、10mg、21.6mg、100mg、216mg、360mg及1g的不同濃度葛根飲品?？疾炱湓?0℃、常溫、0℃、-20℃下的穩(wěn)定性及低溫、高溫環(huán)境對葛根黃酮的破壞性。重點考察了21.6mg/500mL(低濃度)、216mg/500mL(中濃度)、360mg/500mL(高濃度)3個濃度飲品的穩(wěn)定性及極端條件的破壞性。

以葛根素為參考指標，通過紫外分光光度法每3d 1次跟蹤其葛根黃酮的含量變化情況，并以此初步判斷其穩(wěn)定性和極端條件對葛根飲品的影響。在飲品制備和1個月條件考察結束后，以HPLC準確測定其中葛根素的含量，以便完全判斷出其葛根黃酮的變化。

HPLC采用《中華人民共和國藥典》2010版葛根中葛根素的檢測方法，取葛根飲品40℃、常溫、0℃、-20℃低濃度組，微孔濾膜過濾；取葛根飲品40℃、常溫、0℃、-20℃中、高濃度組5mL，加水定容至50mL，微孔濾膜過濾；取 80%葛根素10.21mg甲醇定容至50mL，微孔濾膜過濾，測定原料各組分的含量。

1.2.6 過濾方式對葛根飲品中葛根黃酮含量的影響 考察高速離心、活性炭、硅藻土、微孔濾膜(或反滲透膜)對葛根水的影響，采用前述藥典HPLC條件測定葛根黃酮含量變化。

2 結果與分析

2.1 不同品種葛根中各主要活性成分的含量

標準品及樣品的HPLC圖譜如圖1所示，結果如表2所示。從表2可以看出，葛根(湘葛一號)中葛根素等活性成分含量明顯較高，大豆苷、大豆苷元、染料木素等含量與粉葛相當，且淀粉含量較低，提取較方便，葛根黃酮得率高。粉葛中淀粉含量過高，而葛根素等成分則相對較低，采用回流等傳統(tǒng)方法提取時易出現(xiàn)提取液粘度大等問題，需采用離心等方法才能使溶液與藥渣分離。

圖1 葛根素(a), 大豆苷、大豆苷元和染料木素(b)及葛根樣品(c)的HPLC圖Fig.1 HPLC profiles of puerarin (a), daidzin, daidzein and genistein (b), and sample (C)

表2 不同品種葛根中各主要活性成分的含量(n=3)Tab.2 thecontentsofactivesubstancesindifferentspeciesofPueraria(mg/g)葛根素大豆苷大豆苷元染料木素泰國葛根1.800.21140.04540.1260粉葛3.782.83820.89980.0211湘葛一號28.973.17190.38410.0096葛根莖葉0.0270.02810.00310.0123

2.2 不同濃度乙醇對葛根總黃酮提取率的影響

不同濃度乙醇提取葛根總黃酮，水提取時出現(xiàn)大量泡沫于燒瓶中，而65%乙醇則可以很好地消除泡沫的產生，提取過程便于控制，提取液粘度小，便于過濾以及溶劑回收等，而隨著醇濃度的降低，樣品溶液粘度變大，后處理相對較麻煩。

采用1.2.2色譜條件，得到的標準品及各樣品的高效液相色譜圖如圖2所示，經(jīng)含量計算得到各方法的提取率如表3所示。從圖2、表3可以看出，65%乙醇提取效果最好，其次是水，30%乙醇對葛根素的提取效果較差。采用65%乙醇提取具有提取率高，提取過程容易控制，提取液粘度較小，處理簡單，溶劑回收容易等優(yōu)點。

圖2 葛根素標準品、藥材及不同濃度乙醇提取的葛根提取液樣品HPLC圖(a標準品，b藥材，c 65%乙醇，d 30%乙醇，e水)Fig.2 HPLC profiles of puerarin standard, medicinal material, and the extracts of Pueraria lobata by different concentration of ethanol

表3 不同提取方法對葛根黃酮提取率的影響Tab.3 TheeffectofdifferentextractingmethodsontheextractionpercentofflavonefromPuerarialobata名稱樣品量稀釋倍數(shù)峰面積含量提取率對照品3.53mg 50mL2174787.70.0706mg/mL—原藥材10.1003g50mL2123002.534.36mg/g36.64mg/g(含量平均值)原藥材20.1050g50mL2517012.038.91mg/g65%乙醇10.0g130mL*253086049.332.56mg/g88.86%30%乙醇10.0g140mL*252475914.628.13mg/g76.78%水10.0g143mL*252532382.229.39mg/g80.21%

2.3 葛根黃酮溶解性

葛根黃酮溶解性試驗表明，賴氨酸(0.005mol/L)、組氨酸(0.005mol/L)、精氨酸(0.005mol/L)和苯甲酸鈉(0.05mol/L)等對葛根素有明顯的助溶作用，在該濃度下可使葛根素在水中的溶解度提高1倍左右。通過查找《中華人民共和國藥典》(2010版)，葛根和粉葛的用量為9～15g，以葛根素含量較高的湘葛一號計，其使用量下葛根素的含量約為216～360mg，完全可以不添加任何助溶劑而溶解于500mL純凈水中。

試驗研究還發(fā)現(xiàn)，葛根黃酮并不能迅速溶解于水中，加快溶解的方法主要有加熱、超聲、攪拌、振蕩等，超聲可顯著加快葛根黃酮的溶解，加熱亦因溫度上升葛根黃酮在水中的溶解度增大而溶解加快。溶解后的葛根素室溫下一般不易析出，實際生產中可采用配制濃縮液再加入至純凈水中稀釋至目標濃度再過濾或倒入葛根黃酮粉末加熱攪拌的方式加速溶解。助溶劑的加入有助于提高葛根黃酮的溶解度以及保持其溶解后在溶液中的穩(wěn)定性，但并不能明顯加速葛根黃酮的溶解速率。

2.4 葛根黃酮飲品穩(wěn)定性

以葛根素為參考指標，采用紫外分光光度法測定葛根黃酮的含量變化結果如表4所示，其中UV所得值為標準品、樣品和高濃度飲品稀釋50倍，低濃度及中濃度飲品稀釋25倍后測定的值。

表4 葛根飲品中葛根黃酮含量測定的UV值Tab.4 ThecontentchangeofflavoneinPuerarialobatadrinks天數(shù)標準原料低濃度飲品(21.6mg/500mL)中濃度飲品(216mg/500mL)高濃度飲品(360mg/500mL)-20℃0℃室溫40℃-20℃0℃室溫40℃-20℃0℃室溫40℃10.1190.1280.1730.1670.1580.1671.7421.7691.7761.7711.4351.4321.4361.44040.1560.1560.1541.7601.7781.7701.4341.4381.42970.1660.1680.1651.7621.7721.7671.4361.3671.438100.1780.1780.1701.7551.7811.8401.4311.5031.432130.1760.1780.1721.7691.7731.7961.4351.4391.396160.1750.1770.1741.7711.7731.7811.4361.4311.476190.1980.1780.1941.7861.8131.8201.3531.4261.381220.1750.1770.1811.7761.7851.8021.4151.4231.422250.1720.1730.1701.8721.7941.8381.4111.4531.436280.1780.1780.1701.7551.7811.8401.4311.5031.432310.1200.1260.1710.1710.1710.1701.2501.69110.7311.7500.9551.3551.3531.376

從表4可以看出，低濃度組葛根黃酮含量在-20℃、0℃、常溫及40℃條件下均一直穩(wěn)定。1個月以后觀察，發(fā)現(xiàn)40℃的中、高濃度組與常溫、0℃、-20℃相比，飲品顏色明顯加深，應該是黃酮類化合物高溫下的氧化反應所致，而-20℃條件下的中、高濃度組出現(xiàn)了白色沉淀，葛根素在低溫下從水中析出。

HPLC檢測結果如表5 、表6所示(中、高濃度稀釋10倍測定)。從表5、表6可以看出，在考察時間內，低、中濃度組不同條件下的葛根黃酮含量均無明顯變化，含量穩(wěn)定；高濃度組均有不同程度減少，穩(wěn)定性稍差；中、高濃度組高溫易氧化變色，低溫易沉淀析出，故低濃度組穩(wěn)定性最佳。

表5 不同條件下各濃度飲品活性成分的保留時間、峰面積表Tab.5 Theretentiontimesandpeakareasofactivesubstancesindifferentconcentrationdrinksunderdifferentconditions名稱葛根素大豆苷大豆苷元染料木素時間(min)峰面積時間(min)峰面積時間(min)峰面積時間(min)峰面積葛根素20.2231849056.8——————混合標樣——22.1781440677.830.7492436923.932.7073266412.680%樣20.2314222123.022.144 1194.030.68911211.132.62216510.4低濃度-20℃20.0661202625.8——30.6098091.332.49914560.6低濃度0℃20.0431108452.0——30.6615492.432.56616707.1低濃度室溫20.0861203471.4——30.5955394.732.57116836.8低濃度40℃20.1381154829.8——30.6772446.832.57513901.6中濃度-20℃19.9471174654.2——32.36811133.2中濃度0℃20.0641193425.9——30.62278433.832.57220662.3中濃度室溫20.0641186595.8——30.62077561.532.55620178.5中濃度40℃20.0941230810.7——高濃度-20℃21.4371625297.2——32.2357581.333.904 2867.3高濃度0℃20.0321830162.3——30.6011079.932.46026314.2高濃度室溫20.0321823873.7——30.59511021.232.45826158.7高濃度40℃20.0861858930.6——30.59011657.832.65718618.2

2.5 葛根黃酮飲品口感及感官指標

加入白色的葛根素含量80%的葛根黃酮后，每500mL含葛根素100mg及以下的葛根飲品顏色透明清亮，與純凈水的顏色基本無差別，而100mg以上的飲品則顏色隨濃度的增加而加深，216mg時有弱淡黃色，而1g時可明顯看見完全不同的黃色。在考慮存儲溫度時，以1個月為考察期，0℃和室溫(20～30℃左右)對葛根飲品的顏色沒有明顯影響，而-20℃時21.6mg以上濃度飲品組因溶解度降低而導致有不同程度的白色沉淀析出，40℃時21.6mg以上濃度的葛根飲品顏色與剛配制時相比明顯加深，這是葛根黃酮在高溫下易被氧化所致。

表6 不同條件下各濃度飲品活性成分的含量變化Tab.6 Thecontentchangeofactivesubstancesindifferentconcentrationdrinksunderdifferentconditions(mg/mL)樣品名稱起始結束葛根素標準品0.07060.0706低濃度葛根飲品-20℃0.04300.0459低濃度葛根飲品0℃0.04300.0423低濃度葛根飲品室溫0.04300.0459低濃度葛根飲品40℃0.04300.0441中濃度葛根飲品-20℃0.44850.4485中濃度葛根飲品0℃0.44850.4557中濃度葛根飲品室溫0.44850.4531中濃度葛根飲品40℃0.44850.4696高濃度葛根飲品-20℃0.74790.6206高濃度葛根飲品0℃0.74790.6987高濃度葛根飲品室溫0.74790.6964高濃度葛根飲品40℃0.74790.7098

在各濃度的葛根飲品中，每500mL含2.16mg等低濃度的飲品與純凈水無明顯口感差異，21.6mg級別的飲品口感微苦，并有一種清涼感，適合飲用，而100mg及以上飲品則明顯帶有苦味，口感較差，不建議采用，或加入添加劑以掩蓋黃酮苦味。溫度對飲品的口感影響不大。

2.6 過濾方式對葛根飲品中葛根黃酮含量的影響

試驗表明，活性炭、硅藻土等吸附方式對葛根黃酮的吸附較大，不宜采用，高速離心和微孔濾膜過濾對葛根黃酮含量影響不大(以葛根素為參考指標)。其中，水純化工藝中常用的微孔濾膜或反滲透膜對葛根黃酮的含量影響如表7所示。

表7 過濾方式對葛根飲品中葛根黃酮含量的影響Tab.7 TheeffectoffiltermethodontheflavonecontentofPuerarialobatadrink理論含量(mg/mL)過濾后(mg/mL)得率(%)標準品0.07060.0706—低濃度飲品0.045850.043099.83中濃度飲品0.46170.448597.15高濃度飲品0.74920.747993.74

3 結論與討論

(1) 與泰國葛根、粉葛等品種相比，湘葛一號葛根中葛根素等活性成分含量明顯較高。

(2) 不同濃度乙醇提取葛根總黃酮，以65%乙醇提取效果最好。

(3) 湘葛一號天然葛根飲品的制備過程中，低、中濃度組在不同溫度條件下的葛根黃酮均無明顯變化，含量穩(wěn)定；高濃度組葛根黃酮含量均有不同程度減少，穩(wěn)定性稍差；中、高濃度組葛根黃酮高溫易氧化變色，低溫易沉淀析出，故低濃度組穩(wěn)定性最佳。

(4) 加入葛根素含量80%的葛根黃酮后，每500mL含葛根素100mg及以下的葛根飲品顏色透明清亮，與純凈水的顏色基本無差別。在各濃度葛根飲品中，每500mL含葛根素2.16mg等低濃度的飲品與純凈水無明顯口感差異，21.6mg級別的飲品口感微苦，并有一種清涼感，適合飲用。

(5) 活性炭、硅藻土等吸附方式對葛根黃酮的吸附較大，不宜采用。但高速離心和微孔濾膜過濾對葛根黃酮含量影響不大。

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(文字編校：張 珉)

ActivesubstancesextractionandpreparationfromPuerarialobataforthefunctiondrink

XIONG Lifu1, ZOU Qingpeng2, YE Huixuan3, LIU Xiangqian3

(1.Pueraria Engineering Research Center of Changsha City, Changsha 410005, China; 2.Changsha Bohai Biotech Co.,Ltd., Changsha 410205, China; 3.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

UsingPuerarialobataas raw material and puerarin as evaluation index, the main active substances contents and flavone preparation ofPuerarialobata, the stability and destructibility, the taste and sensory index, and the production technology of flavone drink fromPuerarialobatawere researched. The result showed that, the puerarin content ofPuerarialobatawas obviously higher compared toPuerariathomsonii,PuerariaMirifica. The total flavone ofPuerarialobataextracted with 65% ethanol had the best extract effect. The contents of flavone in low concentration (21.6 mg/500 mL) and medium concentration (216 mg/500 mL)Puerarialobatadrinks were stable under different temperature conditions, while the content of flavone in high concentration (360 mg/500 mL) drink decreased with poor stability. ThePuerarialobataflavone of medium concentration and high concentration drinks were easy to oxidize and change colour under high temperature and easy to precipitate under low temperature, so the low concentration drink had the best stability. The colour ofPuerarialobatadrinks contained puerarin 100 mg and below in 500 mL was transparent and clear, the taste of low concentration drink contained puerarin 2.16 mg in 500 mL had no significant difference with pure water, and the taste of drink contained puerarin 21.6 mg was bitter and cool that was suitable for drinking.

Puerarialobata; flavone; production technology; function drink

2013 — 05 — 17

國家科技支撐計劃(2012BAD20B05-04)。

TS 275.4

A

1003 — 5710(2013)04 — 0033 — 06

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2013. 04. 009