甘 娜， 孔惠敏， 馬玉平， 彭 鏡， 吳麗文， 尹 飛

內(nèi)側(cè)顳葉癲癇(mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)是指源于海馬、杏仁核、海馬旁回的局部癲癇性發(fā)作，是最常見的難治性癲癇之一，早期有效的治療對預(yù)后的改善十分重要。神經(jīng)元丟失、軸突出芽和突觸重建是MTLE慢性期的主要病理改變，也是導(dǎo)致MTLE慢性發(fā)作及難治的病理基礎(chǔ)，但其形成的機(jī)制至今仍未完全闡明。

近年來越來越多的研究顯示，炎癥反應(yīng)及炎癥因子參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展過程，如在癲癇患者手術(shù)切除的海馬組織中，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及其受體表達(dá)增高，炎癥細(xì)胞浸潤增多［1，2］。而白介素作為最早被發(fā)現(xiàn)的炎癥因子，在風(fēng)濕、免疫、創(chuàng)傷等領(lǐng)域均有了廣泛和深入研究，但目前關(guān)于IL-1β與MTLE的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究甚少。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是急性炎癥轉(zhuǎn)錄因子及神經(jīng)元興奮性和膠質(zhì)瘢痕形成的參與因子，有研究顯示［3］海馬硬化患者海馬中NF-κB表達(dá)顯著增加，而MTLE病理進(jìn)展中NF-κB的高表達(dá)是否與IL-1β相關(guān)少見報道。本文就IL-1β與NF-κB在MTLE的作用及相互關(guān)系開展初步觀察研究，以期為MTLE的早期診斷治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物模型制備及分組 21日齡SD大鼠腹腔注射氯化鋰(127mg/kg，美國Sigma)并隨機(jī)分生理鹽水對照組(對照組)、匹羅卡品誘導(dǎo)模型組(模型Ⅰ組)、匹羅卡品誘導(dǎo)及IL-1β干預(yù)組(模型Ⅱ組)。模型Ⅰ組和模型Ⅱ組于注射氯化鋰17～18h后腹腔注射匹羅卡品(50mg/kg，美國Sigma)誘導(dǎo)出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)。模型Ⅱ組在 SE誘發(fā)成功0.5h后側(cè)腦室注射 IL-1β 10ng/kg;對照組予等量生理鹽水代替匹羅卡品腹腔注射。匹羅卡品誘發(fā)癲癇時，達(dá)到Lado幼鼠癲癇發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)5～7級并持續(xù)2h或?yàn)l危時腹腔注射水合氯醛(300mg/kg)終止發(fā)作。于8w(慢性期)后取鼠腦行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 行為學(xué)觀察 急性期誘導(dǎo)SE發(fā)作后每天逐只觀察存活鼠有無反復(fù)自發(fā)癇性發(fā)作(spontaneous recurrent seizures，SRS)以及 SRS 發(fā)作頻率、強(qiáng)度及持續(xù)時間，直至致癇后第8周大鼠SRS基本穩(wěn)定為止，出現(xiàn)SRS即為慢性癲癇幼鼠模型制作成功，模型組中未出現(xiàn)SRS者從模型組剔除。

1.3 腦電圖檢測 模型鼠進(jìn)入慢性期后，麻醉并進(jìn)行電極包埋，術(shù)后單籠飼養(yǎng)1w，隨后進(jìn)行腦電監(jiān)測。每日記錄腦電12h，連續(xù)1w。電極包埋坐標(biāo)為:正中線左2mm，前囟后3.5mm，深2.5mm。

1.4 尼氏染色 選取經(jīng)海馬DG區(qū)、CA1區(qū)、CA3區(qū)的冠狀切片，浸入0.1%焦油紫染液中染色10min，分色(鏡下掌握時間)，流水沖洗后，梯度酒精脫水，二甲苯透明兩次，各10min;中性樹膠封片。鏡下觀察海馬DG區(qū)、CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元丟失程度。計(jì)數(shù)各組海馬各區(qū)神經(jīng)元數(shù)目情況。

1.5 Timm染色 選經(jīng)海馬DG區(qū)、CA3區(qū)的冠狀切片，經(jīng)梯度酒精脫水后，浸入新鮮配制的Timm孵育液。Timm孵育液配方:(1)50%阿拉伯樹膠60ml;(2)檸檬酸鹽緩沖液(檸檬酸鈉2.35g加檸檬酸2.55g溶于10ml蒸餾水);(3)對苯二酚溶液(1.7g對苯二酚溶于30ml蒸餾水);(4)17%硝酸銀溶液1.5ml。暗室內(nèi)新鮮配制。常溫下孵育60～90min，傾去孵育液，取出載玻片，流水沖冼 5～10min終止反應(yīng)，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。光鏡下齒狀回顆粒細(xì)胞及CA3區(qū)錐體細(xì)胞層苔蘚纖維終末因富含Zn2+，能被Timm硫化銀染色方法特異性染色，顯示為棕黃或黑色顆粒。根據(jù)MFS評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

1.6 EMSA檢測NF-κB蛋白在海馬中的表達(dá)

取各組實(shí)驗(yàn)鼠新鮮海馬組織提取核蛋白，以3μg蛋白量上樣，分別加入5×EMSA/Gel-shift結(jié)合緩沖液 2μl、生物素標(biāo)記的 NF-κB 探針1μl，用去 DNA 酶水定容至10μl，室溫靜置20min后，加入10×EMSA/Gel-shift上樣緩沖液1μl，混勻后立即上樣。用0.5 ×TBE 液，150V，電泳 60min。0.5 ×TBE 液，100V，正電荷尼龍膜轉(zhuǎn)膜60min。再于紫外燈下10cm處交聯(lián)10min，然后將膜封閉、洗滌、平衡后，ECL發(fā)光顯影。

1.7 免疫組化檢測NF-κB p65蛋白在海馬中的分布與表達(dá) 取5μm厚的完整海馬石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2作用10min，微波熱修復(fù)，加入一抗(NF-κB p65，1:500;購于 Abcam 公司)4℃孵育過夜。取出后0.1mol/L PBS清洗3次，每次5min，然后參照二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉PV-9000)說明書操作，加入聚合物輔助劑(試劑1)37℃作用30min。0.1mol/L PBS洗5min×3次后，與辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/小鼠IgG多聚體(試劑2)37℃作用30min，PBS浸洗5min×3次。DAB染色10min，流水充分沖洗，蘇木素染核。常規(guī)脫水透明封片。于顯微鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 模型Ⅰ組達(dá)SE并存活的模型大鼠共25只，模型Ⅱ組32只，在急性期模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠均有進(jìn)食進(jìn)水減少、體重增長減緩、激惹、攻擊性增強(qiáng)等表現(xiàn)，并間歇出現(xiàn)驚厥發(fā)作，持續(xù)數(shù)秒至1min不等，但模型Ⅱ組較模型Ⅰ組更加明顯。模型Ⅰ組大鼠上述癥狀于致癇后3～5d逐漸消失;而模型Ⅱ組持續(xù)到致癇后5～7d。致癇后第3周左右陸續(xù)有模型大鼠開始出現(xiàn)自發(fā)癇性發(fā)作，表現(xiàn)為機(jī)械性點(diǎn)頭、咀嚼、前肢陣攣、直立等，可出現(xiàn)全身強(qiáng)直陣攣等大發(fā)作，但發(fā)作時間不長，每次發(fā)作持續(xù)約數(shù)10s～2min不等，可自行終止，發(fā)作頻繁者1d發(fā)作數(shù)次，聲光刺激有時可誘發(fā)發(fā)作。至致癇后第8周自發(fā)發(fā)作基本穩(wěn)定，此時模型Ⅰ組和模型Ⅱ組致SE并存活模型大鼠分別為21只和22只，其中分別有13只和16只出現(xiàn)自發(fā)癇性發(fā)作，即急性期匹羅卡品誘導(dǎo)SE后存活并發(fā)展成為成年期慢性顳葉癲癇的比例為62.9%和72.7%，死亡率為19.4%和31.2%。生理鹽水對照組及急性期未達(dá)SE的模型組大鼠均未見自發(fā)癇性發(fā)作(見表1)。

2.2 EEG監(jiān)測模型鼠海馬異常放電 對照組呈現(xiàn)波幅、節(jié)律基本正常的EEG;模型Ⅰ組和模型Ⅱ組均記錄到腦電圖出現(xiàn)典型尖棘波、棘慢波發(fā)放，波幅明顯增高。

2.3 尼氏染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)元丟失 模型Ⅰ組和模型Ⅱ組各區(qū)均見大量神經(jīng)元脫失，出現(xiàn)空泡樣變性，核固縮;細(xì)胞形態(tài)不完整、細(xì)胞排列松散、紊亂，有較多間隙。于高倍鏡下計(jì)數(shù)神經(jīng)元個數(shù)，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05);模型Ⅰ組與模型Ⅱ組比較有顯著性差異(P＜0.05)。各組海馬各區(qū)神經(jīng)元數(shù)目情況(見表2)。

2.4 Timm染色觀察神經(jīng)元苔蘚樣出芽 對照組大鼠DG區(qū)及CA3區(qū)苔蘚纖維層有密集濃染的黑色顆粒，偶爾或極少見到有苔蘚纖維穿越齒狀回顆粒細(xì)胞層到達(dá)內(nèi)分子層;模型Ⅰ組和模型Ⅱ組可見較多連續(xù)分布的Timm顆粒，與對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)。模型Ⅰ組和模型Ⅱ組比較有顯著差異(P ＜0.05)(見表3)。

2.5 EMSA檢測模型鼠海馬內(nèi)NF-κB的表達(dá)

NF-κB在模型Ⅰ組海馬內(nèi)表達(dá)增加，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05);模型Ⅱ組中NF-κB的表達(dá)增加，與對照組比和模型Ⅰ組比較均有顯著性差異(P ＜0.05)。

2.6 IHC觀察模型鼠海馬內(nèi)NF-κB p65的表達(dá) 對照組少見 NF-κB p65表達(dá)強(qiáng)陽性細(xì)胞，且NF-κB p65在細(xì)胞核內(nèi)少有表達(dá)。模型Ⅰ組內(nèi)NF-κB p65表達(dá)增加，且陽性細(xì)胞較集中分布，可見NF-κB p65由胞漿向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移;模型Ⅱ組中NF-κB p65的表達(dá)增加和核內(nèi)轉(zhuǎn)移更為明顯。于高倍鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽性率，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)，模型Ⅰ組與模型Ⅱ組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 各組模型鼠癲癇發(fā)作及死亡情況

表2 各模型組與對照組海馬各區(qū)神經(jīng)元數(shù)目(χ±s)

表3 對照組與模型組海馬DG區(qū)內(nèi)分子層MFS評分(χ±s)

3 討論

作為最常見的癲癇亞型，MTLE被認(rèn)為是因高熱驚厥、癲癇持續(xù)狀態(tài)、腦炎、腫瘤、外傷等引發(fā)的繼發(fā)性功能改變所致，并且存在5～10年甚至更長的潛伏期，繼而形成慢性自發(fā)癲癇［4］，目前對于該病的治療主要還是通過藥物或其他生物方法控制癲癇的發(fā)作，以減少驚厥給大腦造成的損害，而針對病因的治療甚少，這主要是由于該病作用機(jī)制尚不明了。

炎癥是最常見且重要的基本病理過程，早前觀點(diǎn)認(rèn)為由于血腦屏障的存在，大腦成為了免疫豁免場所，炎癥反應(yīng)是不參與癲癇發(fā)生發(fā)展的，但是近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在癲癇的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用［5］。而作為前炎癥因子的IL-1β被認(rèn)為與癲癇的發(fā)生有密切的相關(guān)性。有報道IL-1β途徑參與了癲癇的發(fā)病過程［6］，IL-1β甚至被認(rèn)為是熱性驚厥致顳葉癲癇海馬硬化的啟動因子［7］。Zheng等［8］亦報道小膠質(zhì)細(xì)胞能通過分泌IL-1β促進(jìn)海馬神經(jīng)元的活化。我們早先的研究［9］也發(fā)現(xiàn)，在匹羅卡品致癇的MTLE模型中，模型鼠海馬內(nèi)的IL-1β在急性期和慢性期表達(dá)增加。這都提示IL-1β可能對癲癇的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。但也有報道認(rèn)為IL-1β在對神經(jīng)發(fā)生存在負(fù)性調(diào)控，如IL-1β可以抑制神經(jīng)發(fā)生并減少驚厥所致的神經(jīng)變性［10，11］;而腹腔或側(cè)腦室注射小劑量的 IL-1β 似乎能起到抗癲癇的作用［12，13］。由此可見IL-1β在癲癇病理過程中的作用機(jī)制復(fù)雜，正性及負(fù)性的調(diào)控均存在于病理過程之中。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，大鼠致癇后再注射IL-1β可以加重實(shí)驗(yàn)鼠在急性期的癇性發(fā)作，模型Ⅱ組大鼠較模型Ⅰ組表現(xiàn)得更為焦躁、攻擊性強(qiáng)，并且這種狀態(tài)持續(xù)時間以及急性期反復(fù)的驚厥發(fā)作次數(shù)均較模型Ⅰ組明顯。進(jìn)入慢性癲癇自發(fā)發(fā)作期后，模型Ⅱ組的癲癇自發(fā)發(fā)生率較模型Ⅰ組高(P＞0.05)，腦電圖改變更加明顯，這說明IL-1β可以加劇模型鼠的癇性發(fā)作，并促進(jìn)慢性期MTLE模型的發(fā)病。進(jìn)一步利用Nissl染色和Timm染色觀察到，模型Ⅱ組神經(jīng)元脫失和苔蘚樣出芽均較模型Ⅰ組改變明顯，這提示，IL-1β在促進(jìn)模型鼠自發(fā)癲癇的過程中伴隨有大量海馬神經(jīng)元的死亡，并且導(dǎo)致了Mossy纖維的大量增生，這正是神經(jīng)元異常放電和癲癇慢性自發(fā)發(fā)作的病理基礎(chǔ)。

NF-κB體系主要涉及機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細(xì)胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞，是免疫反應(yīng)及炎癥應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。NF-κB在細(xì)胞內(nèi)受到多種物質(zhì)調(diào)控，如IL-1β、TNF-α、IL-2等，而NF-κB活化后，亦可增強(qiáng)前述各物質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄，使其釋放增多，從而導(dǎo)致炎癥信號的進(jìn)一步放大。此外在癲癇的神經(jīng)病理發(fā)作過程中，亦觀察到NF-κB起著重要調(diào)節(jié)作用。諸多研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在驚厥發(fā)作及癲癇慢性自發(fā)發(fā)作過程中均表達(dá)增加［3］，而向癲癇模型鼠體內(nèi)注射NF-κB抑制劑PDTC可以減少模型鼠的驚厥發(fā)作［14］，這提示 NF-κB可能是MTLE發(fā)生中的關(guān)鍵通路之一。實(shí)驗(yàn)中，我們也證實(shí)模型Ⅰ組海馬內(nèi)NF-κB表達(dá)增加，并且觀察到最具代表性的活性亞基NF-κB p65出現(xiàn)明顯的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，這說明NF-κB可能是匹羅卡品誘導(dǎo)的MTLE的疾病發(fā)生和進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。既然NF-κB與炎癥和癲癇病理均存在著密切關(guān)系，那么NF-κB是否能夠作為一個契合點(diǎn)在炎癥與癲癇的發(fā)生過程中起到橋梁的作用呢?目前關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)病變中IL-1β與 NF-κB的關(guān)系研究存在不同報道，有研究［15］認(rèn)為 IL-1β 作為 NF-κB 的上游炎癥因子，通過IL-1RI調(diào)節(jié)NF-κB的核轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響神經(jīng)發(fā)生、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙等。Pitkanen［16］等亦報道 IL-1β 通過激活 MAPK 及 NF-κB依賴途徑對癲癇病理過程進(jìn)行分子改變、離子通道等的調(diào)節(jié)。同樣也有研究認(rèn)為［17］TNF-α、IL-1β、GMCSF等的調(diào)節(jié)均通過NF-κB途徑。而我們通過向致癇模型海馬內(nèi)注射IL-1β可以觀察到，模型Ⅱ組大鼠海馬內(nèi)NF-κB的表達(dá)較模型Ⅰ組更加明顯，結(jié)合行為學(xué)觀察以及神經(jīng)元改變程度，我們有理由認(rèn)為IL-1β可以通過活化NF-κB并增加其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MTLE大鼠模型慢性期的癲癇自發(fā)發(fā)作。

綜上所述，增加海馬內(nèi)IL-1β的表達(dá)，可以使匹羅卡品誘導(dǎo)的MTLE模型鼠海馬癲癇慢性自發(fā)發(fā)作率增加，這可能與IL-1β通過促進(jìn)NF-κB活化和表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)元脫失和Mossy纖維增生，最終導(dǎo)致神經(jīng)元異常放電和癲癇慢性自發(fā)有關(guān)。而炎癥與癲癇病理、IL-1β與NF-κB在此過程中的相關(guān)性還有待進(jìn)一步的動物模型及體外研究，對這一問題的深入研究，可能為MTLE的防治提供新的思路。

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