王慶 董海燕 包訓迪 趙秀芹 徐東芳 萬康林

結(jié)核病是當今全球范圍對人類最具威脅的傳染性疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計顯示，全球結(jié)核病發(fā)病率以每年1%的比率上升，約每年新增患者880萬［1］。現(xiàn)代的分子生物學技術與傳統(tǒng)的結(jié)核流行病學相結(jié)合，形成新的結(jié)核分子流行病學。多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析（multiple locus variable number tandem repeat analysis，MLVA）就是該學科的一個較典型的范例［2］。MLVA是一種以PCR技術為基礎的方法，其操作簡單、分辨率高、結(jié)果分析容易，具有很高的可重復性，在實驗室內(nèi)和實驗室間具有非常好的可比性，并能提供數(shù)字化的分型信息，適宜進行大量樣本和網(wǎng)絡化分析［3］。本研究選取391株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，采用Supply等［4］新推薦的MLVA（15位點）進行基因分型，以初步了解安徽部分地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因型分布及其流行情況，探討其在今后結(jié)核病控制中的應用價值。

材料和方法

一、材料

391株結(jié)核病臨床分離菌株來自于安徽省胸科醫(yī)院2011年1—6月的臨床痰標本，所有菌株鑒定為結(jié)核分枝桿菌，-80℃菌株庫保存，標準菌株H37Rv由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供，作為本實驗的對照菌株。

二、方法

1．結(jié)核分枝桿菌DNA模板的制備：將結(jié)核分枝桿菌臨床分離株常規(guī)接種于L-J培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4～8周，至有菌落生長后，取一接種環(huán)的菌于400μl TE緩沖液（pH 8．3）中懸菌，100℃煮沸15min，13 059×g離心5min后，上清液備用。

2．PCR擴增：采用25μl PCR反應體系，其中包括2μl模板 DNA、1．5mmol MgCl2，0．2mmol dNTP、上下游引物共30pmol和1．5UTaq DNA酶。分別用15對引物進行PCR擴增。PCR反應條件：預變性94℃10min；循環(huán)94℃1min，62℃1min，72℃15min，共40個循環(huán)；最后延伸72℃10min。15個位點及引物序列參照文獻［5］，引物由上海生物工程有限公司合成，詳見表1。

3．結(jié)果檢測：2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，GoldViewTM核酸染料染色，用100bp PCR Marker來確定相對分子質(zhì)量的大小，以標準菌株H37Rv作為對照，計算出不同結(jié)核分枝桿菌各個可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（variable number tandem repeats，VNTR）位點的相對分子質(zhì)量和重復次數(shù)。

4．結(jié)果分析：先用Gel-Pro analyzer 3．1軟件對凝膠進行數(shù)字化處理，將指紋圖譜數(shù)字化后，再用BioNumerics（Version5．0）數(shù)據(jù)庫軟件進行聚類分析，將實驗菌株進行分型處理。

5．計算 Hunter-Gaston分辨率指數(shù)（Hunter-Gaston index，HGI）：計算各位點等位基因多樣性（h）以及不同VNTR位點組合的HGI，公式如下［6］：

xi為第i等位基因在某個VNTR位點出現(xiàn)的頻率，N為實驗菌株總數(shù)。

N為菌株總數(shù)，S是所用分型方法劃分的總類型數(shù)，nj是屬于第j類型的菌株數(shù)。

6．計算菌株成簇率：實驗結(jié)果完全相同的菌株定義為一簇，成簇率為成簇菌株占總試驗菌株的百分率。

表1 VNTR位點、重復片段大小及其在H37Rv中的重復次數(shù)

續(xù)表1

結(jié) 果

一、檢測標本結(jié)果的重復性

陽性對照菌株DNA在同一VNTR位點的擴增片段大小相同。從檢測標本中抽取40株菌株，每株不同VNTR位點重復檢測3次，每次DNA擴增片段大小完全相符。

二、MLVA多態(tài)性檢測

本次共選取了15個特異性較好的VNTR位點來進行檢測分析，結(jié)果顯示安徽省結(jié)核分枝桿菌的DNA指紋圖譜呈現(xiàn)明顯的多態(tài)性（圖1～4），不同位點的多態(tài)性即h具有較大差異，其中Mtub21位點顯示多態(tài)性最高（h為0．591），其次，MIRU26位點h為0．527；ETR-B、ETR-C、ETR-D和 MIRU23顯示較低多態(tài)性，h 分別為0．125、0．08、0．124和0．137，詳見表2。VNTR-15位點 HGI為0．913。

圖1 不同菌株在Mtub21位點的PCR產(chǎn)物電泳圖

二、MLVA分型

表2 391株結(jié)核分枝桿菌15個MLVA位點重復單位多態(tài)性分布

表3 391株結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性和VNTR特征分布關系

1．MLVA分型：經(jīng)BioNumerics 5．0軟件聚類分析，391株分為4個基因群（Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群），其中Ⅰ群占3．32%（13／391），Ⅱ群占3．07%（12／391），Ⅲ群所占比例最大，為89．00%（348／391），含140個基因型，Ⅳ群占4．60%（18／391）；391株菌共含183個基因型，呈明顯多態(tài)性，其中149株為獨特類型，余242株分為34簇，成簇率61．89%（242／391），簇的范圍為2～64，最大的一簇包含64株（基因型為424343357333544），占所有菌株的16．4%（64／391）。

2．基因型與耐藥性的相關性分析：表3結(jié)果顯示，391株結(jié)核分枝桿菌耐藥率占25．06%（98／391），Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群耐藥率分別為30．77%、25．00%、24．71%和27．78%，經(jīng)卡方檢驗，基因群分布與藥敏間的差異無統(tǒng)計學意義（P值均＞0．05）。其中Ⅲ型348株中，利福平耐藥率占19．54%（68／348），異煙肼耐藥率占17．53%（61／348），同時耐異煙肼與利福平（MDR-TB）的有45株，占12．93%（45／348）。

討 論

自1998年Frothingham和Meeker-O’Connell首次使用了11個VNTR位點進行基因分型后，近年來許多國家都開展了對這種分型方法的研究，出現(xiàn)了許多種位點的組合方式。Mtb基因組中包含許多類似真核細胞中小衛(wèi)星序列的散在重復單元（mycobacterial interspersed repetitive unit，MIRU），H37Rv全基因組序列測定結(jié)果顯示：Mtb基因組中存在41個散在分布的MIRU位點，VNTR位點在Mtb中的分布表現(xiàn)為高度的個體特異性。每個特定的VNTR位點由兩部分組成，包括中間的核心區(qū)和外圍的側(cè)翼區(qū)。核心區(qū)是由含有至少1個的40～100bp的重復單元組成。一般該重復單元的堿基對數(shù)目不變，而串聯(lián)在一起的重復單元的數(shù)目是可變的；外圍的側(cè)翼序列具有高度的保守性［7］。

本研究的患者均來源于安徽省法定專業(yè)結(jié)核病防治機構(gòu)（安徽省結(jié)核病研究所和安徽省胸科醫(yī)院），連續(xù)收集391例痰培養(yǎng)陽性的結(jié)核病患者，初步反映了安徽省部分地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因分布情況。VNTR位點的等位基因多態(tài)性是用于評價各位點對不同菌株的分型能力的指標，就每一個位點而言，它表現(xiàn)為不同菌株在該位點重復序列拷貝數(shù)的不同。Hawkey等［8］根據(jù)不同位點的等位基因多樣性的不同，將其分為3個等級：高分辨能力（h＞0．6），中等分辨能力（0．3≤h≤0．6）和低分辨能力（h＜0．3）。筆者研究發(fā)現(xiàn)VNTR-15位點的總體分辨率是0．913，不同位點之間的多態(tài)性差異很大。其中Mtub21、MIRU26具有較高的分辨能力，ETR-E、MIRU10、MIRU40和 Mtub39分辨能力一般，而ETR-B、ETR-C、ETR-D和MIRU23的分辨能力較差。在本研究中其余位點的分辨能力也較差，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果并不完全一致［9-11］，可能原因有兩點：（1）安徽具有某一主要流行菌株，即菌株本身的同源性較高，這對位點分型能力的評估造成了一定程度的影響；（2）本研究中所選擇的15個位點尚不足以將所有不同的菌株區(qū)分開，提示還應篩選更多的多態(tài)性較好的位點組合起來用以區(qū)分菌株、提高其分型能力。

391株結(jié)核分枝桿菌通過MLVA分型，可分為4個基因群 （Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群），以Ⅲ群為優(yōu)勢流行菌型，共183個基因型，34個簇，成簇率為61．89%（242／391），最 大 簇 為 64 株 （基 因 型 為424343357333544），說明這34例患者中的每一例患者至少與另外一例患者具有完全相同的基因型，體現(xiàn)了高的成簇率，提示了高度近期傳播的可能性。另一方面，可能是筆者采用的分型方法其分辨率不足，未能將有區(qū)別的菌株區(qū)分開，以致于出現(xiàn)了不精細的成簇，這就需要對更多的位點進行篩選尋找一種最優(yōu)的位點組合，使得分型結(jié)果更趨于真實，最大限度地提高其分型能力。但該結(jié)果仍提示應加強對安徽地區(qū)主要流行菌株的控制，加速發(fā)現(xiàn)傳染源，及時切斷傳播途徑，增強易感人群的抵抗力和身體素質(zhì)，在最大程度上減少傳播的發(fā)生。如應加強基層單位防治結(jié)核的分子流行病學手段，增加特異性位點，對于菌株成簇情況的判定還可能進一步精確，更真實的反映出Mtb的近期傳播情況，有利于指導傳染源的追蹤。本次分析的391株Mtb耐藥率占25．06%（98／391），經(jīng)卡方檢驗，基因群分布與藥敏間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。通過對Ⅲ型菌株的耐藥性比較，發(fā)現(xiàn)68株對利福平有耐藥性，占19．54%（68／348），提示安徽省耐藥菌株的監(jiān)測應重點注意耐利福平菌株的流行趨勢。

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