宋英健 王正 張國良 李巍 張明霞 陳心春 楊林

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種世界性的傳染病，感染范圍波及全球1／3的人群，但感染者中只有10%發(fā)展為有癥狀的活動性結(jié)核病，這說明活動性結(jié)核病患者對結(jié)核病的易感因素有別于健康人。而在活動性結(jié)核病患者中臨床表現(xiàn)的差異也在一定程度上表明結(jié)核病患者之間的易感因素存在差別［1］。結(jié)核病在不同人種之間的差異性和雙胞胎之間關(guān)聯(lián)性都說明除環(huán)境和暴露因素外，宿主遺傳因素對結(jié)核病發(fā)生發(fā)展也起到了不可忽視的作用，因此針對結(jié)核病易感基因的研究已成為近年研究的熱點［2-3］。眾所周知，細胞免疫在結(jié)核病免疫反應(yīng)中起著重要作用。而轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）作為一個多功能的細胞因子，可以干擾細胞免疫對于結(jié)核病的應(yīng)答［4］。而且由于TGFβ1可以促進細胞外基質(zhì)合成，導(dǎo)致組織纖維化［5］，其與結(jié)核性胸膜炎也有密切的關(guān)系，其中宿主遺傳學(xué)因素可能起著重要的作用。

國外研究也表明，在伊朗人群中TGFβ1單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphisms，SNP）位點rs1800470與結(jié)核病的發(fā)生具有相關(guān)性［6］。但是有關(guān)TGFβ1位點與深圳市漢族人群結(jié)核病相關(guān)性研究未見報道。本研究選取的位點rs4803455，其作為標簽SNP（tag SNP，tSNP），不僅攜帶大量SNP信息，而且與動脈粥樣硬化有密切的關(guān)系［7］。國外報道稱，動脈粥樣硬化和結(jié)核病發(fā)病機制和表現(xiàn)具有相似性，其均為慢性起病，并影響巨噬細胞作用，逃避免疫反應(yīng)，均形成壞死灶（粥樣硬化斑塊和干酪樣壞死）［8］。所以，筆者利用TaqMan-PCR技術(shù)分析探討廣東省深圳市漢族人群中TGFβ1基因tSNP（rs4803455）位點與結(jié)核病的關(guān)系，尋找TGFβ1（rs4803455）位點基因多態(tài)性與結(jié)核病、特別是結(jié)核性胸膜炎的相關(guān)性。

資料和方法

一、研究對象

選取深圳市人民醫(yī)院和深圳市第三人民醫(yī)院2008年12月至2010年11月收治的深圳市漢族結(jié)核病患者。結(jié)核病組總共373例。所有結(jié)核病患者的診斷均通過其臨床表現(xiàn)、影像學(xué)診斷、病原學(xué)診斷的結(jié)果（根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》）［9］確診。肺結(jié)核組111例，均根據(jù)痰、肺部手術(shù)、肺活檢組織經(jīng)細菌學(xué)或病理學(xué)結(jié)果確診（痰培養(yǎng)陽性26例，痰涂片陽性56例，肺部手術(shù)或肺活檢組織病理學(xué)檢測為結(jié)核29例）。結(jié)核性胸膜炎患者組57例，根據(jù)引流后的胸腔積液、胸膜活檢組織經(jīng)細菌學(xué)或病理學(xué)診斷結(jié)果確診（胸腔積液確診13例，胸膜活檢組織確診44例）。其他205例結(jié)核病患者臨床確診。對照組為健康體檢和義務(wù)獻血者，共350名。排除標準：合并支氣管哮喘、肺炎、塵肺、糖尿病、腫瘤、動脈硬化等慢性疾病，合并HIV感染、器官移植、使用腎上腺皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑等。所有入選對象均為HIV陰性。其中結(jié)核組中男251例，女122例，年齡（35．9±33．6）歲。對照組中男138名，女212名，年齡（34．8±30．3）歲。肺結(jié)核組中男78例，女33例，年齡（38．0±29．3）歲。結(jié)核性胸膜炎組中男39例，女18例，年齡范圍（34．9±32．4）歲。

二、檢測方法

（一）血液標本的采集和DNA的提取、純化及保存

采集研究對象外周靜脈血1．5ml。采用肝素鋰抗凝后利用血液DNA提取試劑盒（Qiagen，德國）從外周血中提取DNA并純化，取DNA樣本1μl，用分光光度計NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，美國）測定DNA純度和濃度。若A260／A280＞1．8，A260／A230＞2．0，則 DNA 純度合格，純化的DNA經(jīng)瓊脂糖水平電泳儀（上海領(lǐng)成生物科技有限公司）電泳驗證其質(zhì)量，并標化濃度值為5ng／μl，-20℃保存。

（二）DNA等位基因檢測分析

1．位點SNP分型：選取上述研究對象所提取的合格DNA樣本，利用TaqMan-PCR技術(shù)檢測rs4803455位點基因類型。其TaqMan探針和引物來自于美國AB公司成品的TaqMan試劑盒（Assay ID：C＿30031638＿10）。TaqMan探針實驗反應(yīng)體系為10μl，其中通用PCR混合液（2×TaqMan Genotyping Master Mix）5．0μl，引物與探針混合液（40×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix）0．25μl，DNA（50ng／μl）1．0μl，然后加入重蒸水（ddH2O）至10μl。實驗過程為讀取擴增前熒光信號、生成擴增數(shù)據(jù)、讀取擴增后的熒光信號。擴增的反應(yīng)條件為95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40個循環(huán)［10］。

2．結(jié)果判定：此SNP位點的等位基因A與等位基因C的探針分別采用綠色熒光素（greenfluorescent protein，VIC）和羧基熒光素（carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）進行標記。樣本為等位基因A的純合子時，PCR擴增過程中僅能檢測到VIC熒光；樣本為等位基因C的純合子時，PCR擴增過程中僅能檢測到FAM熒光；樣本為雜合子時，PCR擴增過程中可同時檢測到FAM和VIC兩種熒光。

3．結(jié)果分析及處理：計算各組等位基因頻率，確定是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。各組等位基因頻率差異采用χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)核病與TGF-β1等位基因的相關(guān)性通過計算比值比 （odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（95%confidence intervals，95%CI）來表示。統(tǒng)計學(xué)分析由SPSS 13．0統(tǒng)計學(xué)分析軟件處理。

結(jié) 果

一、等位基因分型結(jié)果

采用TaqMan探針技術(shù)檢測DNA樣本rs4803455等位基因類型，等位基因頻率和基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，說明檢測結(jié)果有代表性。

其位點等位基因頻率結(jié)核組和對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)核組等位基因C的基因頻率（68．2%）高于對照組（59．4%）（表1）。

二、分層分析

1．性別分層：由于結(jié)核組中男性比例較對照組高，采用性別分層分析rs4803455位點等位基因頻率，結(jié)果顯示：兩組男性和女性之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)核組等位基因C的基因頻率均高于對照組（表2）。

2．年齡分層：根據(jù)既往研究［11］按照年齡分層發(fā)現(xiàn)，rs4803455位點等位基因頻率在年齡≤25歲中差異無統(tǒng)計學(xué)意義，然而在年齡＞25歲中差異有統(tǒng)計學(xué)意義。等位基因C在結(jié)核組中均高表達（表3）。

3．臨床類型分層：由于TGFβ1與結(jié)核性胸膜炎具有相關(guān)性，根據(jù)臨床類型從結(jié)核病患者中挑選出有病理學(xué)或者細菌學(xué)證據(jù)的肺結(jié)核組和結(jié)核性胸膜炎組。分別與對照組進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該位點等位基因頻率在對比分析中肺結(jié)核組、結(jié)核性胸膜炎與對照組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表4）。兩組等位基因C的基因頻率均高于對照組，在結(jié)核性胸膜炎組更加明顯。

表1 結(jié)核組和對照組rs4803455等位基因頻率的對比

表2 結(jié)核組和對照組中不同性別等位基因頻率的對比

表3 結(jié)核組和對照組不同年齡組等位基因頻率的對比

表4 肺結(jié)核組和結(jié)核性胸膜炎組與對照組等位基因頻率的對比

討 論

眾所周知，結(jié)核分枝桿菌侵入機體后，結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸不僅取決于結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量和毒力，很大程度上還取決于機體的免疫狀態(tài)?？菇Y(jié)核免疫主要是通過細胞免疫，而大多數(shù)結(jié)核病患者都存在免疫功能紊亂、免疫力低下的現(xiàn)象［12］。TGFβ1是一類多功能細胞因子，在細胞免疫調(diào)節(jié)方面主要發(fā)揮免疫抑制作用［13］。文獻報道，能夠抑制T細胞特別是Th1的增殖，促進其凋亡［14］。其主要通過下調(diào)白細胞介素2（IL-2）介導(dǎo)的增殖信號來抑制有絲分裂，從而抑制T細胞增殖；對于已激活的T細胞，通過促進T細胞生長停滯、G1期細胞的積累，增加其對凋亡的敏感度。除此之外TGFβ1能夠下調(diào)干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的產(chǎn)生和活性，降低中間產(chǎn)物活性氧的釋放，從而導(dǎo)致單核巨噬細胞失活［15］。而且國外研究也表明，免疫調(diào)節(jié)因子TGFβ1在結(jié)核病患者血清、巨噬細胞和肺泡灌洗液中表達升高，升高的TGFβ1與結(jié)核病復(fù)燃有密切的關(guān)系［2，16］。綜上所述，TGFβ1通過干擾Th1細胞應(yīng)答和巨噬細胞活化，抑制了炎癥反應(yīng)，降低了機體的抗菌能力，從而降低了結(jié)核病患者的免疫功能，導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展。本實驗利用TaqMan-PCR檢測技術(shù)，對廣東省深圳市漢族結(jié)核病患者和健康人TGFβ1基因rs4803455位點基因型進行檢測，尋找其與結(jié)核病的相關(guān)性。

結(jié)果表明，rs4803455位點在結(jié)核組和對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中等位基因C在結(jié)核組頻率較對照組高，也明顯高于國外文獻報道，而對照組中等位基因C基因頻率與國外文獻報道相近［17］。提示其可能作為危險因素在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在性別分層分析中，男性、女性之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而在年齡分層中rs4803455位點等位基因頻率在年齡≤25歲組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義，然而在年齡＞25歲組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示rs4803455位點基因型在年齡＞25歲組預(yù)測作用更大，而年齡本身與基因類型無關(guān)。其差別可能是由于年齡作為一個獨立因素，可以影響機體免疫功能，從而影響TGFβ1免疫應(yīng)答造成。具體原因需要更多的實驗研究證實。

Li等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中TGF-β1和IL-10抑制結(jié)核保護性免疫細胞Th1細胞的活性，降低IFN-γ的分泌，導(dǎo)致機體免疫力下降。所以，本研究依據(jù)位點rs4803455檢測結(jié)果分別比較已通過細菌學(xué)或者病理學(xué)明確診斷的肺結(jié)核組、結(jié)核性胸膜炎組與對照組之間等位基因頻率的差異，尋找之間的差異。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義，而且在結(jié)核性胸膜炎組中等位基因C為危險因素，其等位頻率明顯高于肺結(jié)核組。

由于SNP位點間存在連鎖不平衡現(xiàn)象，相關(guān)聯(lián)SNP位點包含的遺傳信息相互重疊，具有冗余性，單個普通SNP位點又缺乏疾病代表性。而International HapMap Consortium［19］運用單體型分型的方法找出了約50萬個tSNP來代表整個人類基因圖譜之中的SNP集合，這些tSNP與表型間的關(guān)聯(lián)性更大。基因位點rs4803455作為tSNP位點代表大量的SNP信息，增加了SNP分型的有效性，對多基因疾病研究極其重要。國外文獻報道該位點位于TGF-β1內(nèi)含子區(qū)域，其與動脈粥樣硬化、近視眼發(fā)病均有密切的關(guān)系［7，20］，其中等位基因C作為危險因素在患者組中均高表達，而且其與已報道跟結(jié)核病具有相關(guān)性的rs1800470位點存在連鎖不平衡現(xiàn)象，其中rs4803455等位基因C與rs1800470等位基因C具有明顯的正相關(guān)性［20］。而研究者已發(fā)現(xiàn)在rs1800470位點含有等位基因C的人群血漿中TGF-β1濃度明顯升高［21］，從而也可以判斷在rs4803455位點含有等位基因C的人群中血漿中TGF-β1濃度也存在升高現(xiàn)象。這可能是rs4803455位點等位基因C攜帶者更易引起結(jié)核病患者臨床癥狀的主要原因。具體原因有待更多的研究來尋找其與TGF-β1表達和結(jié)核病的關(guān)系。但是作為tSNP的rs4803455位點對于結(jié)核的預(yù)測作用較rs1800470更大。

綜上所述，TGF-β1中tSNP（rs4803455）位點的基因多態(tài)性可能與深圳地區(qū)中國漢族人群結(jié)核病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，其在結(jié)核性胸膜炎患者的相關(guān)性更加明顯，而在年齡＞25歲的患者中這種預(yù)測作用更大。通過對結(jié)核病遺傳易感性的進一步研究將有助于對結(jié)核病特別是結(jié)核性胸膜炎的高危人群進行預(yù)測，并尋找可能的干預(yù)措施以降低結(jié)核病的發(fā)病率，為最終控制結(jié)核病疫情提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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