張慶生，李 波，張鳳蘭，裴新榮，陳志蓉，王鋼力，達(dá) 晶，王春香，林瑞超(.中國食品藥品檢定研究院，北京 00050;.北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京 006))

紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的作用，是一種應(yīng)用非常廣泛的傳統(tǒng)中藥材［1］。隨著科技進(jìn)步和制藥業(yè)的發(fā)展，紅花注射液被廣泛應(yīng)用于閉塞性腦血管病、冠心病、脈管炎等疾病的治療，并取得了一定的療效，但中藥注射劑的安全問題逐漸浮出水面，主要表現(xiàn)在因中藥注射劑引起的各種過敏反應(yīng)，輕者引起皮疹、呼吸苦難，重者可導(dǎo)致過敏性休克［2-4］。這既威脅患者的身體健康，也對我國中藥制藥業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的傷害。因此，構(gòu)建一個(gè)監(jiān)測中藥制劑、尤其是中藥注射劑的過敏性反應(yīng)監(jiān)控、評價(jià)平臺，對篩查中藥制劑過敏原殘留、優(yōu)化制劑工藝、預(yù)防過敏反應(yīng)的發(fā)生具有重要意義。食物、植物、藥物、制藥雜質(zhì)殘留等都可能誘導(dǎo)過敏反應(yīng)，而花粉是自然界最常見的過敏原之一［5-6］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用紅花花粉蛋白免疫小鼠，通過篩選針對花粉蛋白的特異性單克隆抗體，嘗試構(gòu)建針對紅花注射液的過敏原篩查平臺，為優(yōu)化紅花制劑生產(chǎn)工藝、加強(qiáng)質(zhì)量控制及預(yù)防臨床過敏反應(yīng)提供新的思路和方法。

1 材料

1.1 儀器

酶標(biāo)儀(BIO-RAD 680)，DEM-3型自動(dòng)洗板機(jī)(北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn))，二氧化碳培養(yǎng)箱SANYO，HD-4層析工作站(上海滬西儀器廠生產(chǎn))，層析柱(Phamacia)，蛋白電泳裝置(BioRadⅡ)，蛋白定量檢測儀(Amersham Biosciences)

1.2 藥品與試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT(次黃嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶脫氧核苷T)培養(yǎng)基、100×HT(次黃嘌呤H、胸腺嘧啶脫氧核苷 T)培養(yǎng)基(、聚乙二醇(PEG)4000、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)、山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP、Sp2/0細(xì)胞株(由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供)。抗體亞型檢測試劑盒(SBA Clonotyping System/HRP)(購自 SouthernBiotech公司)，透析袋(購自 BLUEBIRD公司)，超濾管(購自Millipore公司)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)(購自Pierce公司)。紅花花粉由山西太原華衛(wèi)藥業(yè)有限公司提供。

1.3 動(dòng)物

BABL/c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)，清潔級，合格證號:SCXK蘇2012-0004。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥品的制備

稱取紅花花粉50 g，加入250 ml水，煮2 h，過濾后取濾液80 ml，加入預(yù)冷的無水乙醇120 ml(60%)，放置4℃過夜(17 h)，5000 rpm/min離心20 min，棄上清液，沉淀即為紅花花粉總蛋白，應(yīng)用Bradford方法檢測蛋白含量。將紅花花粉總蛋白作為免疫原。

2.2 免疫方案

選取5只雌性BLAB/c小鼠進(jìn)行免疫，具體免疫流程如下:第 1 次免疫，按蛋白量 80 μg/只，250 μl/只，配合應(yīng)用完全弗氏佐劑，背部皮下多點(diǎn)免疫;第2次加強(qiáng)免疫，按蛋白量40 μg/只，250 μl/只，配合應(yīng)用不完全弗氏佐劑在初次免疫后一周加強(qiáng)免疫;第3、4次加強(qiáng)免疫方案與第1次加強(qiáng)免疫相同;第 5 次加強(qiáng)免疫按蛋白量 80 μg/ml，100 μl/只，采用脾內(nèi)加強(qiáng)免疫方式進(jìn)行。

2.3 細(xì)胞融合和克隆

第5次加強(qiáng)免疫后3 d，取小鼠脾細(xì)胞，采用PEG常規(guī)融合方法，將小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0細(xì)胞株進(jìn)行融合。采用間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)方法對融合細(xì)胞上清進(jìn)行篩選，經(jīng)過2次篩選確認(rèn)陽性細(xì)胞孔后，采用有限稀釋法對陽性細(xì)胞株進(jìn)行克隆。

2.4 抗體亞型檢測

SBA Clonotyping System/HRP購自Southern Biotech公司，按試劑盒操作說明進(jìn)行檢測。

2.5 腹水制備

取BALB/c小鼠，每只注射0.5 ml石蠟油，7 d后將雜交瘤細(xì)胞按1×106個(gè)細(xì)胞/0.5 ml/只給小鼠接種，接種細(xì)胞約7～14 d后收集腹水備用。

2.6 抗體純化

采用結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)平衡Protein G親和柱至基線平穩(wěn);將腹水樣品上柱，收集流穿液;將流穿液再次上柱，繼續(xù)平衡至基線平穩(wěn);加入洗脫緩沖液(Eluting Buffer)洗脫，收集洗脫峰，檢測純度;用0.01 M，pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析收集的洗脫峰，使純化后的抗體保存在0.01 M，pH值為7.2的PBS中;用蛋白定量檢測儀測定純化后單抗的濃度;對純化后的抗體進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，上樣量 8 μg/抗體。

2.7 抗體特異性鑒定

將紅花蛋白按 10 μg/ml，100 μl/孔，4 ℃ 包被過夜。洗滌3次后，加入150 μl/孔3% 牛血清白蛋白(BSA)，37℃封閉2 h;洗滌3次后，將單克隆抗體按 1:3000稀釋，100 μl/孔37℃孵育2 h;洗滌3次后，將辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶5000 稀釋后，100 μl/孔，37 ℃ 孵育 1 h;加入 1 × TMB，37℃顯色15～30 min，加入50 μl/孔 2 M 硫酸(H2SO4)終止反應(yīng)。以450 nm單波長測定各孔OD值，以與陰性對照孔OD值的比值(P/N)＞2.1為限，作為判斷抗體陽性、效價(jià)或特異性的臨界點(diǎn)。

3 結(jié)果

3.1 免疫后血清效價(jià)檢測結(jié)果

經(jīng)過4次免疫后，5只小鼠血清效價(jià)的檢測結(jié)果見表1(應(yīng)用硫酸鹽緩沖液作為空白對照)。結(jié)果顯示，5只小鼠均已達(dá)到融合標(biāo)準(zhǔn)，其中3號小鼠的效價(jià)最高。

表1 紅花花粉蛋白免疫血清效價(jià)檢測結(jié)果(OD450 nm)Tab 1 Determination results on antisera titration of safflower pollen protein(OD450 nm)

3.2 單克隆細(xì)胞株的篩選

細(xì)胞融合后第3、6 d對融和板進(jìn)行換液，于第7 d對融合細(xì)胞進(jìn)行篩選。共有3個(gè)陽性細(xì)胞孔，為保證陽性率的穩(wěn)定，再擴(kuò)至24孔以再次檢測確定。檢測結(jié)果表明3株均為陽性。應(yīng)用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，經(jīng)過3次亞克隆后陽性率達(dá)100%，得到1B6，2A11，6H11共3個(gè)單克隆細(xì)胞株。

3.3 抗體亞型的鑒定

按試劑盒提供方法對所獲得的3個(gè)單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，鑒定結(jié)果見表2。1B6、2A11、6H11表示3株細(xì)胞克隆的編號，產(chǎn)生的單克隆抗體應(yīng)用相同編號。檢測結(jié)果表明所獲3株細(xì)胞產(chǎn)生的抗體亞型均為IgG1型。

表2 單克隆抗體亞型鑒定(OD450 nm)Tab 2 Subtype identification of monoclonal antibodies(OD450nm)

3.4 抗體特異性鑒定

應(yīng)用間接ELISA方法，進(jìn)一步檢測各單克隆抗體對紅花蛋白抗原識別的特異性，檢測結(jié)果見表3。單克隆抗體1B6、2A11、6H11較相應(yīng)空白對照組(應(yīng)用硫酸鹽緩沖液作為空白對照)分別增加了9.63、9.59和6.61倍，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，各單克隆抗體均能特異性識別紅花蛋白抗原，均具有較強(qiáng)的特異性。

表3 單克隆抗體對紅花花粉蛋白的特異性識別(OD450 nm)Tab 3 Specificity recognition of monoclonal antibodies on safflower pollen protein(OD450nm)

圖1 單克隆抗體對紅花花粉蛋白的特異性識別Fig 1 Specificity recognition of monoclonal antibodies on safflower pollen protein

4 討論

4.1 中藥注射劑引起的過敏問題

傳統(tǒng)中藥主要通過口服、外敷等方式應(yīng)用，再則中藥強(qiáng)調(diào)辨證論治、君臣佐使，單種藥物成分濃度相對較低，因此，歷來認(rèn)為中藥毒副作用較小，比較安全。隨著科技進(jìn)步和制藥業(yè)的發(fā)展，中藥注射劑、滴丸、噴霧劑等多種劑型在臨床應(yīng)用越來越廣泛。但傳統(tǒng)中藥應(yīng)用過程中較少出現(xiàn)的毒副作用，如中藥注射劑引起的過敏性休克時(shí)常發(fā)生，并逐漸成為阻礙中藥應(yīng)用、制約企業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，探索中藥注射劑致敏的主要原因和發(fā)生機(jī)制，以改善制藥工藝，消除過敏反應(yīng)的發(fā)生成為當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵問題。

4.2 中藥注射劑誘導(dǎo)過敏的機(jī)制

與西藥注射劑相比，中藥注射劑常常成分復(fù)雜，誘導(dǎo)過敏反應(yīng)發(fā)生的原因也更為復(fù)雜。有研究認(rèn)為［7］，中藥過敏發(fā)生的原因與年齡、性別無關(guān)，主要與給藥途徑有關(guān)，尤其是注射用藥最易誘發(fā)過敏反應(yīng)。于風(fēng)平等［8］用間接ELISA的方法篩查刺五加注射液中的過敏性雜質(zhì)成分，并建議應(yīng)用超濾技術(shù)去除過敏性雜質(zhì)。紅花、清開靈、雙黃連注射劑等［4，9］均有誘發(fā)過敏反應(yīng)的報(bào)道，另外制藥中使用的聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(吐溫-80)等還可誘導(dǎo)類過敏反應(yīng)的發(fā)生［10］。中藥藥物成分、制藥雜質(zhì)和給藥途徑都是引起過敏或類過敏現(xiàn)象發(fā)生的重要原因。

4.3 構(gòu)建過敏反應(yīng)評價(jià)平臺的目的和意義

由于缺乏適宜的中藥注射劑過敏和類過敏反應(yīng)評價(jià)模型，這成為制約中藥注射劑發(fā)展的重要瓶頸。植物花粉是最為常見的致敏原之一，本研究以紅花花粉蛋白作為研究的突破口，希望通過構(gòu)建針對紅花花粉蛋白的特異性細(xì)胞克隆、制備特異性單克隆抗體，作為研究紅花注射劑過敏原鑒定、篩選的重要工具，也為改良紅花注射劑制藥工藝、降低過敏反應(yīng)的發(fā)生提供技術(shù)支撐。目前，我們已經(jīng)構(gòu)建了3株針對紅花花粉蛋白的細(xì)胞克隆，經(jīng)鑒定均產(chǎn)生IgG1型抗體，效價(jià)較高。應(yīng)用ELISA的方法，進(jìn)一步證明這3個(gè)單克隆抗體均能識別紅花花粉蛋白，并且具有較好特異性。今后，我們將以3個(gè)單克隆抗體作為研究工具，首先鑒定單克隆抗體識別紅花花粉蛋白的免疫原結(jié)構(gòu)，再探索紅花花粉蛋白與紅花注射劑誘導(dǎo)過敏反應(yīng)發(fā)生之間的關(guān)系，研究紅花注射劑關(guān)鍵的致敏原因，并希望研發(fā)出能夠快速篩查紅花注射劑過敏原殘留的試劑盒，用于改善紅花制劑工藝、降低過敏反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。期望以此作為工作基礎(chǔ)，研究開發(fā)出針對多種中藥成分的單克隆抗體，將我們的過敏反應(yīng)評價(jià)體系，逐步拓展成為研究和評價(jià)各類中藥注射劑過敏反應(yīng)的通用平臺，這將對我國中藥制藥的發(fā)展產(chǎn)生積極的推動(dòng)作用，具有非常重要的意義。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［S］.2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:141-142.

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