張 曲，宋益民，李 江

(1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，青島 山東 266042；2.國家海洋局 第一海洋研究所，青島 山東 266061)

微生物在當(dāng)今被普遍認(rèn)為是一些生物活性物質(zhì)和新化合物的高效生產(chǎn)者[1]。而生存于極地的微生物由于氣候極其苛刻、惡劣，這也意味著來自于極地微生物的生物活性物質(zhì)對(duì)于人類可能具有特殊的意義[2]。極地微生物(海冰微藻和細(xì)菌)分泌產(chǎn)生大量的胞外多糖(EPSs)，這些物質(zhì)聚集在冰藻和細(xì)菌生存的海冰通道中，提供了海冰和冰水界面的有機(jī)碳，是能源傳輸?shù)闹饕镔|(zhì)[3]。除了其生態(tài)學(xué)上的作用，國內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注胞外多糖的生物學(xué)活性，在前期的研究工作中，從南極嗜冷桿菌Psychrobactersp. B-3的發(fā)酵液中分離獲得的胞外糖能夠顯著地誘導(dǎo)植物體內(nèi)多種抗氧化酶的活性，以清除植物在受到傷病侵害時(shí)大量積累的活性氧，從而有效地防治設(shè)施蔬菜的病害。單獨(dú)施用EPS-B3對(duì)黃瓜白粉病和枯萎病的防治率分別達(dá)到42.99%和83.09%，因而具有廣闊的開發(fā)潛力[4]。但微生物EPSs產(chǎn)量低而不穩(wěn)定限制了其開發(fā)應(yīng)用，因此如何提高EPSs的產(chǎn)量顯得尤為重要。

響應(yīng)面法是先利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過實(shí)驗(yàn)得到的一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[5]。本研究以南極菌Psychrobactersp.B-3菌株為研究對(duì)象，通過單因子實(shí)驗(yàn)，Plackett-Burman設(shè)計(jì)，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，高效地實(shí)現(xiàn)了南極菌Psychrobactersp.B-3產(chǎn)胞外多糖的優(yōu)化，為該胞外多糖以后的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

南極菌B-3源自中國第24次南極科學(xué)考察烏拉圭站(62°11′50.52″S，58°55′50.4″W)采集的海冰樣品，采用佐貝爾2216培養(yǎng)基篩選、分離獲得，經(jīng)16S rDNA鑒定為Psychrobacter屬。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，陳海水：自來水為2:1，即2216E培養(yǎng)基。

初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，陳海水：自來水為2:1，MgCl20.02 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)的初始溫度為10 ℃, pH為7，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，發(fā)酵時(shí)間為72 h。

1.2 方 法

1.2.1 苯酚-硫酸法總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖10 mg，加入100 mL容量瓶中，定容至刻度，濃度為100 μg/mL。利用苯酚-硫酸法測(cè)出葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

1.2.2 單因素篩選

分別以溫度、pH、碳源、氮源、金屬離子及海水配比作為參數(shù)進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)產(chǎn)糖量的影響。為確定各種環(huán)境因素對(duì)南極菌Psychrobactersp.B-3發(fā)酵產(chǎn)糖量的影響水平，通過選擇最佳的碳源，氮源及金屬離子來進(jìn)行下一步的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析

根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)及其它可能影響產(chǎn)糖的因素，選擇了10個(gè)因素：蛋白胨(X1)，酵母粉(X2)，海水配比(X3)，pH(X4)，溫度(X5)，搖床轉(zhuǎn)速(X6)，接種量(X7)，裝液量(X8)，培養(yǎng)時(shí)間(X9)，BaCl2(X10)，來進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn)(N=12)，用Plackett-Burman軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)因素分別設(shè)高(1)，低(-1)兩個(gè)水平。以發(fā)酵液中的產(chǎn)糖量為響應(yīng)值，通過SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸顯著性水平，選擇可信度高的顯著因素進(jìn)一步開展響應(yīng)面顯著性分析，根據(jù)結(jié)果對(duì)其進(jìn)行顯著性分析。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)因素根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定2個(gè)水平。

1.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定的影響產(chǎn)糖的顯著因素，采用響應(yīng)面軟件對(duì)其進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以發(fā)酵液中的產(chǎn)糖量為響應(yīng)值，通過SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，從而獲得南極菌B-3發(fā)酵產(chǎn)糖的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程為y=0.002 3x-0.004 8(R2=0.991 3)。

2.2 單因子實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果

我們分別考察了溫度、pH、碳源、氮源、金屬離子及海水配比對(duì)產(chǎn)糖量的影響(圖1～6)。結(jié)果表明，最佳碳源為酵母粉，最佳氮源為蛋白胨，最佳金屬離子為BaCl2，陳海水與自來水配比為2:1，溫度10 ℃，pH為7。

圖1 不同溫度對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig.1 Effect of various temperatures on EPS production

圖2 不同pH對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig. 2 Effect of various pH on EPS production

圖3 不同碳源對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig.3 Effect of various carbon sources on EPS production

圖4 不同氮源對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig.4 Effect of various nitrogen sources on EPS production

圖5 不同海水比例對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig. 5 Effect of various seawater proportions on EPS production

圖6 不同無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)糖的影響Fig. 6 Effect of various salts on EPS production

2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選結(jié)果

在前期單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選取可能影響產(chǎn)糖的10個(gè)因素：蛋白胨、酵母粉、海水配比、pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量、培養(yǎng)時(shí)間、BaCl2。來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)。10個(gè)因素分別對(duì)應(yīng)于表1中的10個(gè)列，每個(gè)因素分別取低水平“-1”和高水平“1”，并另設(shè)1個(gè)虛擬列，考察實(shí)驗(yàn)誤差，以發(fā)酵液中產(chǎn)糖質(zhì)量濃度為響應(yīng)值(Y)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。運(yùn)用SAS軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的t值和可信度水平，各因素主效應(yīng)分析見表2。

一般選擇可信度大于90%以上的因素作為顯著因素[7]。由表2的主效應(yīng)分析結(jié)果可知，在PB設(shè)計(jì)的二水平范圍內(nèi)，影響南極菌B-3產(chǎn)糖的主要因素為酵母粉濃度、海水配比和裝液量，其可信度區(qū)間均在90%以上。由于發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源均已確定，而其他因素對(duì)產(chǎn)糖的影響不顯著，故在下一步響應(yīng)面分析中需要進(jìn)一步考察酵母粉濃度、海水配比和裝液量對(duì)產(chǎn)糖量的影響，其余不顯著因素按照正負(fù)效應(yīng)確定，正效應(yīng)取高值，負(fù)效應(yīng)取低值，即蛋白胨6 g/L，接種量1.5 %，培養(yǎng)時(shí)間64 h，BaCl20.03 g/L，并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)際情況將溫度定為10 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，pH為7。

表1N=12的Plackett-Burman的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 1 Experimental design of Plackett-Burman and corresponding results(N=12)

表2Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及效應(yīng)分析Table 2 Factors, levels and effect estimates of Plackett-Burman design

2.4 響應(yīng)面分析

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇酵母粉濃度、海水配比和裝液量為優(yōu)化對(duì)象，以發(fā)酵液中產(chǎn)生的總糖含量為響應(yīng)值來設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，所設(shè)計(jì)的重要因素水平及編碼見表3，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表4。

表3響應(yīng)面因素水平編碼表Table 3 Factors and levels of response surface design

表4Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Experimental design and results of Box-Behnken

2.4.2 二次回歸方程擬合及方差分析

回歸方程的方差分析和可信度分析結(jié)果分別見表5和表6。

表5回歸方程的方差分析Table 5 ANOVA for the RSM experiment

表6模型可信度分析Table 6Reliability analysis for the modle

通過回歸方程的方差分析(表5)可知，回歸模型F值檢驗(yàn)顯著(P=0.000 1<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.090 8>0.05)，即該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合較好。從模型可信度分析(表6)可知，其決定系數(shù)(R2)=99.40%，這表明由這3個(gè)因素及其二次項(xiàng)能解釋響應(yīng)值(Y)變化的99.40%，說明模型的相關(guān)度較高；校正決定系數(shù)(Adj.R2)=98.64%，表明98.64%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性能用此回歸模型解釋；預(yù)測(cè)決定系數(shù)(Pred.R2)=0.924 5,預(yù)測(cè)決定系數(shù)較高，說明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的可靠性達(dá)92.45%,說明模型可靠性較好；Y的變異系數(shù)(C.V.)=1.48%，較低，說明實(shí)驗(yàn)操作性較高。由此可見，該回歸模型具有較好的擬合度，可用該回歸方程對(duì)南極菌B-3產(chǎn)糖量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

在α=0.05的顯著水平上，3個(gè)關(guān)鍵因素在所確定的濃度范圍內(nèi)對(duì)產(chǎn)糖的影響都是顯著的，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照其對(duì)結(jié)果的影響排序?yàn)?酵母粉濃度>海水配比>裝液量。

2.4.3 響應(yīng)面分析顯著因子水平的優(yōu)化

利用SAS軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，通過回歸方程來繪制分析圖，考察所擬合的相應(yīng)曲面形狀，酵母粉濃度、海水濃度、裝液量之間的立體分析圖和等高圖見圖7～9。

結(jié)合圖7～9，運(yùn)用響應(yīng)面軟件進(jìn)行分析，在回歸方程中存在穩(wěn)定點(diǎn)為極大值，得到極大值所對(duì)應(yīng)的各主要因素(C1，C2，C3)的編碼值分別為(0.331,0.204,0.084),其對(duì)應(yīng)的實(shí)際值為(1.07,65.05,50.84)，即酵母粉濃度、海水濃度、裝液量的最佳值分別為1.07 g/L，65.05%，50.84%，而此時(shí)模型發(fā)酵液中的產(chǎn)糖量最高，其預(yù)測(cè)值為613 μg/mL。

圖7 酵母粉濃度和海水濃度對(duì)產(chǎn)糖的交互影響Fig. 7 Reciprocal effect of yeast extract concentration and seawater concentration on EPS production

圖8酵母粉濃度和裝液量對(duì)產(chǎn)糖的交互影響Fig. 8 Reciprocal effect of yeast extract concentration and liquid volume on EPS production

圖9海水濃度和裝液量對(duì)產(chǎn)糖的交互影響Fig. 9 Reciprocal effect of seawater concentration and liquid volume on EPS production

2.4.4 模型實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性，以模型分析確定影響產(chǎn)糖主要因素的濃度來配置發(fā)酵培養(yǎng)基，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的合理性，確定酵母粉濃度為1.1 g/L，陳海水與自來水的配比為2∶1，裝液量為50%，其余發(fā)酵條件按Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定，即蛋白胨6 g/L，接種量1.5%，培養(yǎng)時(shí)間64 h，BaCl20.03 g/L，溫度10 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，pH為7，共進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)，每組至少3個(gè)樣本進(jìn)行發(fā)酵。3組的平均產(chǎn)糖量分別為621 μg/mL,619 μg/mL，632 μg/mL，均值為624 μg/mL。這是原始發(fā)酵培養(yǎng)基平均444 μg/mL產(chǎn)糖量的1.4倍，產(chǎn)量提高了40%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值較接近，說明回歸方程能夠比較真實(shí)地反映各篩選因素對(duì)產(chǎn)糖量的影響，可見，用該回歸模型優(yōu)化南極菌B-3產(chǎn)糖發(fā)酵培養(yǎng)基和條件是可行的。

3 討 論

糖類是自然界分布最廣、含量最豐富的生物高分子聚合物，也是自然界中分子結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的一類物質(zhì)[9]。它們與蛋白質(zhì)、核酸、脂肪一起組成了生物體內(nèi)最重要的四類高分子化合物。糖的研究在經(jīng)歷了1個(gè)多世紀(jì)的緩慢發(fā)展之后，從20世紀(jì)70年代開始，隨著分離分析技術(shù)的進(jìn)步和分子生物學(xué)的發(fā)展，逐漸又得到了復(fù)興，并取得了巨大進(jìn)展，糖生物學(xué)研究正成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域又一新的前沿和熱點(diǎn)[10]。

一些糖類物質(zhì)具有抗腫瘤，抗氧化性，和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等非常有益的特性[11]。有些糖類物質(zhì)特別適合用于制造功能性食品，這些糖類具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，并在眾多領(lǐng)域擁有著誘人的前景[12]。目前，我國雖在一些糖類的研究中取得了一定的進(jìn)展，但在糖類的工業(yè)化過程中還存在著糖產(chǎn)量較低，產(chǎn)糖菌種較少等問題。因此，關(guān)于一些產(chǎn)糖菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化就顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的生物過程優(yōu)化大多采用單一的單因素設(shè)計(jì)，較繁雜的正交設(shè)計(jì)或單一的響應(yīng)面分析[13]。而本研究針對(duì)單一使用響應(yīng)面法的不足之處，高效整合單因子實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)、響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,準(zhǔn)確快速地實(shí)現(xiàn)了南極菌Psychrobactersp.B-3菌株產(chǎn)胞外多糖條件的優(yōu)化研究，獲得了理想的結(jié)果。本研究從眾多影響產(chǎn)胞外多糖的因素中篩選出了主要因素并實(shí)現(xiàn)了因素水平的優(yōu)化，較大地提高了南極菌B-3的產(chǎn)糖量，為以后的擴(kuò)大生產(chǎn)和工業(yè)化利用打下了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。

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