徐永江, 柳學(xué)周*, 王妍妍

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島， 266071；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所 青島市海水魚(yú)類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島， 266071)

圓斑星鰈(VeraspervariegatusT.&S.)屬鰈形目(Pleuronectiformes)，鰈科(Pleuronectidae)，星鰈屬(Verasper)，主要分布于我國(guó)黃海、渤海、東海以及日本，朝鮮等海域，其肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值高，是一種極具人工養(yǎng)殖和資源增殖開(kāi)發(fā)利用前景的優(yōu)良魚(yú)種。自上世紀(jì)90年代以來(lái)，研究者們一直在試圖通過(guò)控制其繁殖周期來(lái)實(shí)現(xiàn)該魚(yú)種的人工繁殖，并在資源調(diào)查[1-2]、親魚(yú)培育和激素誘導(dǎo)產(chǎn)卵[3]方面進(jìn)行了積極嘗試和研究，積累了較多有關(guān)繁殖生物學(xué)的基礎(chǔ)資料。

資源調(diào)查資料表明，自然條件下圓斑星鰈雌性親魚(yú)性成熟的最低年齡為3齡[4]。目前，圓斑星鰈在人工養(yǎng)殖條件下，人工雌性親魚(yú)甚至4齡以上才能真正用于人工繁殖，且經(jīng)人工調(diào)控后產(chǎn)卵的成功率也相對(duì)較低，人工采卵獲得優(yōu)質(zhì)卵子的幾率不高。近年來(lái)研究產(chǎn)卵使用的親魚(yú)都是自然海域捕獲的野生親魚(yú)在人工條件下馴養(yǎng)后用于繁殖，子一代親魚(yú)的人工繁殖少有成功。由于自然資源的嚴(yán)重下降，自然海域的圓斑星鰈種群逐年縮小，因此從人工養(yǎng)殖群體選擇具備優(yōu)良性狀的個(gè)體來(lái)補(bǔ)充親魚(yú)群體是保證養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑，對(duì)于可用于繁殖群體補(bǔ)充的后備親魚(yú)個(gè)體，其生殖特性和生殖潛力是評(píng)價(jià)其可否作為后備親魚(yú)的必要條件[5]。

外源激素可誘導(dǎo)人工養(yǎng)殖魚(yú)類性腺發(fā)育成熟并排卵[6]，還可加速魚(yú)類性腺成熟[7]、克服人工養(yǎng)殖條件下的親魚(yú)發(fā)育不良不能正常排卵的情況[8-10]。因此，我們利用外源激素誘導(dǎo)2齡雌性圓斑星鰈后備，以卵巢發(fā)育特征和性類固醇激素表達(dá)水平變化為指標(biāo)，以期認(rèn)識(shí)圓斑星鰈2齡后備親魚(yú)的生殖內(nèi)分泌特性，評(píng)價(jià)其在人工養(yǎng)殖條件下的生殖潛力，為人工親魚(yú)的優(yōu)選和群體構(gòu)建提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2010年在青島忠海水產(chǎn)有限公司開(kāi)展了3齡以上圓斑星鰈親魚(yú)(全長(zhǎng)39～62 cm，體重1 200～2 800 g)的促熟調(diào)控產(chǎn)卵研究，使用2個(gè)容積為25 m3的圓形水泥池作為親魚(yú)培育池，培育親魚(yú)數(shù)量75尾。親魚(yú)餌料為活沙蠶、貝肉。日投喂2次，投喂量為魚(yú)體重的2%～3%，及時(shí)清除殘餌、排污。對(duì)親魚(yú)進(jìn)行溫度和光照調(diào)控，培育池以黑色不透光幕布圍遮，水溫由自然海水和地下井水混合調(diào)控。光照由白熾燈(60 W)提供，調(diào)節(jié)水面光照強(qiáng)度為280 lx。產(chǎn)卵期結(jié)束后，親魚(yú)重新置于自然光照和水溫下。親魚(yú)培育條件：周年培育水溫8～23 ℃，鹽度29～32，pH 7.8～8.2，溶解氧6 mg/L以上，日換水率300%～500%。親魚(yú)周年培育水溫和光周期變化見(jiàn)圖1。

本實(shí)驗(yàn)使用2齡的圓斑星鰈子一代人工后備親魚(yú)45尾，實(shí)驗(yàn)魚(yú)全長(zhǎng)300～380 mm，體重565～780 g。本研究使用的F1代2齡圓斑星鰈后備親魚(yú)與達(dá)性成熟的親魚(yú)共同培育，于2009-10開(kāi)始進(jìn)行溫光調(diào)控。

圖1 親魚(yú)周年培育水溫和光照時(shí)間變化Fig.1 Year round photothermal conditioning schedule used to mature captive broodstocks

本實(shí)驗(yàn)于2010-03進(jìn)行，當(dāng)性成熟親魚(yú)性腺隆起較為明顯且發(fā)育達(dá)IV期以上時(shí)，將30尾2齡實(shí)驗(yàn)用親魚(yú)從培育池取出，用于激素誘導(dǎo)發(fā)育試驗(yàn)，剩余的15尾實(shí)驗(yàn)魚(yú)留在親魚(yú)池繼續(xù)進(jìn)行培育。實(shí)驗(yàn)魚(yú)自親魚(yú)培育池取出后，在4 m3的方形水泥池中開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)組，共使用水泥池3個(gè)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組放置實(shí)驗(yàn)魚(yú)10尾。實(shí)驗(yàn)魚(yú)培育條件和餌料投喂及管理同親魚(yú)培育池。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)3周。實(shí)驗(yàn)用激素購(gòu)自寧波第二激素廠(寧波，中國(guó))，實(shí)驗(yàn)組別、使用激素種類、注射劑量及使用親魚(yú)數(shù)量見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)魚(yú)在實(shí)驗(yàn)池中適應(yīng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(0 h)每尾魚(yú)按照設(shè)計(jì)劑量注射生理鹽水及激素，在48 h時(shí)進(jìn)行二次注射，劑量同第1次。激素注射前，先以160 mg/L的MS-222麻醉實(shí)驗(yàn)魚(yú)，使用1 mL的無(wú)菌注射器在實(shí)驗(yàn)魚(yú)背部肌肉部位進(jìn)行激素誘導(dǎo)注射。

表1 實(shí)驗(yàn)使用激素種類、注射劑量及使用親魚(yú)數(shù)量Table 1 The hormones, dosage and number of fish used in the present study

注：“-”為進(jìn)行任何激素和生理鹽水處理

1.2 取樣方法及樣品處理

血液取樣：對(duì)以生理鹽水、GnRH和LHRH處理的實(shí)驗(yàn)魚(yú)定時(shí)抽取血液。在第1次激素注射后的6 h、12 h、24 h、48 h、96 h、192 h和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別抽取血液樣品，每次取樣實(shí)驗(yàn)魚(yú)5尾。血液取樣時(shí)，實(shí)驗(yàn)魚(yú)以160 mg/L的MS-222麻醉后置于鋪有干凈濕潤(rùn)毛巾的泡沫板上進(jìn)行。取血使用1 mL無(wú)菌注射器，采用背面尾靜脈抽血方法，每尾魚(yú)抽血1 mL，保存在1.5 mL eppendorf離心管中，15 000 r/min離心10 min后，分離上層血清，保存在-40 ℃?zhèn)溆谩?/p>

組織樣品取樣：在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、192 h分別取樣4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)魚(yú)各3尾，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(480 h)將實(shí)驗(yàn)魚(yú)全部取樣。取樣實(shí)驗(yàn)魚(yú)時(shí)，首先將實(shí)驗(yàn)魚(yú)使用MS-222(300 mg/L)麻醉致死，小心解剖取出性腺、肝臟在Davis固定液中固定24 h后轉(zhuǎn)入70 %酒精保存。性腺樣品經(jīng)酒精梯度(70%～100%)脫水，石蠟包埋，切成7～9 μm厚的切片，蘇木精伊紅染色后，中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察(NIKON)，拍照。

在取樣過(guò)程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行生物學(xué)測(cè)量，包括體重(BW)、體長(zhǎng)(BL)、內(nèi)臟重(VW)、性腺重(GW)、肝臟重(LW)。分別計(jì)算性腺指數(shù)(GSI)=[GW/(BW-VW)]×100%；肝臟指數(shù)(HSI)=[LW/(BW-VW)]×100%；肥滿度(CF)=[BW/(BL)3]×100%。

1.3 性類固醇激素水平測(cè)定

采用放射免疫法(RIA)對(duì)雌二醇(E2)和睪酮(T)進(jìn)行測(cè)定。使用125I標(biāo)記的哺乳動(dòng)物E2和T放射免疫測(cè)定試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)。T回收率95%～108%，靈敏度1.9 ng/dl，批內(nèi)變異系數(shù)7.4%，批間變異系數(shù)9.8%，其特異性表達(dá)為與雙羥睪酮交叉反應(yīng)率≤1.6×10-4，雄烯二酮≤2.1×10-6，孕酮(PROG)≤5.0×10-6，雌三醇(E3)≤5.2×10-8，E2≤5.0×10-4。E2回收率95%～104%，靈敏度2.1 pg/mL，批內(nèi)變異系數(shù)7.7%，批間變異系數(shù)8.9%，其特異性表達(dá)為與E3交叉反應(yīng)率≤9.0×10-4，PROG≤1.0×10-4，T≤1.0×10-4，雌酮≤7.0×10-3，膽固醇≤1.0×10-5。試劑盒非特異性結(jié)合率≤3%，特異性結(jié)合率≥30%。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果均表示為平均值±S.D.的形式，使用SPSS(16.0版本)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。利用單因素方差分析法(ANOVA)檢測(cè)GSI、HSI、CF、血漿雌二醇、睪酮的表達(dá)水平變化以及肝臟細(xì)胞直徑的變化，取差異顯著性(P)為0.05，P≤0.05視為差異顯著，反之不顯著。

2 結(jié) 果

本研究表明，留在親魚(yú)培育池繼續(xù)培育的實(shí)驗(yàn)魚(yú)未能排卵，組織切片檢查發(fā)現(xiàn)性腺僅發(fā)育至Ⅳ期后，而采用注射法進(jìn)行外源激素誘導(dǎo)子一代2齡后備雌性親魚(yú)性腺中卵母細(xì)胞可發(fā)育至5時(shí)相早期，雖然最終也未能達(dá)到成熟排卵，但表明外源激素誘導(dǎo)對(duì)性腺發(fā)育起到了積極的促進(jìn)作用。

2.1 卵巢數(shù)量特征變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，GnRH處理組圓斑星鰈雌魚(yú)有40%可見(jiàn)卵巢部位的隆起，而Control組、LHRH組以及自然溫光組未見(jiàn)親魚(yú)卵巢部位的隆起。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，GnRH組實(shí)驗(yàn)魚(yú)的GSI值最大，達(dá)到11.51±2.64，而LHRH處理組實(shí)驗(yàn)魚(yú)相對(duì)較小為8.36±1.82，最小的為對(duì)照組僅為3.76±1.15，自然溫光組為4.23±1.55。GnRH處理組和LHRH處理組實(shí)驗(yàn)魚(yú)的肝重指數(shù)(0.84～0.96)和肥滿度(0.61～0.82)都大于對(duì)照組和自然溫光組(0.65～0.79)，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2 血漿性類固醇激素的表達(dá)水平變化

對(duì)照組親魚(yú)血漿性類固醇激素表達(dá)水平變化不顯著，雌二醇表達(dá)水平在48 h達(dá)峰值，其后保持一定的表達(dá)水平的波動(dòng)。LHRH組雌魚(yú)血漿雌二醇水平在激素注射6 h后顯著升高(P<0.05)，隨后又顯著下降，雖在24 h又有升高，但在其后的時(shí)間表現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的變動(dòng)，在48 h進(jìn)行LHRH組二次注射后，激素水平僅在72 h稍微上升，在其后的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持相對(duì)穩(wěn)定的水平。GnRH組雌魚(yú)血漿雌二醇水平表現(xiàn)出與LHRH組類似的表達(dá)變化規(guī)律，但144 h前雌二醇表達(dá)水平都高于LHRH組(除72 h)，其后其表達(dá)水平低于LHRH組雌魚(yú)。上述組雌二醇的表達(dá)水平在72 h后都低于對(duì)照組雌魚(yú)血漿的雌二醇表達(dá)水平(圖2)。

對(duì)照組親魚(yú)血漿睪酮表達(dá)水平在144 h達(dá)峰值，其后逐漸下降。各實(shí)驗(yàn)組雌魚(yú)血漿睪酮表達(dá)水平也發(fā)生較為明顯的波動(dòng)。在LHRH組，第一次激素注射后，血漿睪酮表達(dá)水平顯著下降至12 h時(shí)低于檢測(cè)限，其后在48 h達(dá)峰值(P<0.05)，在第二次注射后睪酮表達(dá)水平逐漸下降并保持相對(duì)較低。GnRH組呈現(xiàn)類似的表達(dá)規(guī)律，但在48 h后的血漿睪酮表達(dá)水平相對(duì)高于LHRH組。另外，除48 h、72 h和96 h外，對(duì)照組雌魚(yú)血漿中睪酮表達(dá)水平都高于實(shí)驗(yàn)組(圖3)。

圖2 激素誘導(dǎo)后血漿中雌二醇表達(dá)水平變化Fig. 2 Serum estradiol expression level after hormones treatment

圖3 激素誘導(dǎo)后血漿中睪酮表達(dá)水平變化Fig.3 Serum testosterone expression level after hormones treatment

2.3 卵巢中卵母細(xì)胞組成變化

圓斑星鰈卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞發(fā)育的特征及其劃分參見(jiàn)徐永江等[11]的描述，本研究觀察到的卵母細(xì)胞發(fā)育特征見(jiàn)圖4。

對(duì)取樣的實(shí)驗(yàn)魚(yú)卵巢進(jìn)行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組親魚(yú)卵巢中卵母細(xì)胞組成為4時(shí)相早期、3時(shí)相、2時(shí)相卵母細(xì)胞，以2時(shí)相卵母細(xì)胞占據(jù)優(yōu)勢(shì)，表明2齡雌性親魚(yú)卵巢發(fā)育可進(jìn)入卵黃發(fā)生期，但在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持不變，卵母細(xì)胞不能繼續(xù)發(fā)育成熟。自然溫光組親魚(yú)卵巢發(fā)育情況與對(duì)照組親魚(yú)基本相似。

使用外源激素誘導(dǎo)192 h后，LHRH處理組雌魚(yú)卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞組成為4時(shí)相、3時(shí)相和2時(shí)相卵母細(xì)胞，只不過(guò)3時(shí)相和2時(shí)相卵母細(xì)胞比例相對(duì)減少，4時(shí)相卵母細(xì)胞比例增加，且4時(shí)相卵母細(xì)胞可發(fā)育到中后期。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(480 h)，性腺中可見(jiàn)少量發(fā)育至5時(shí)相的卵母細(xì)胞，其特點(diǎn)為核仁和核膜崩解， 4時(shí)相卵母細(xì)胞多數(shù)為發(fā)育至中后期的卵母細(xì)胞。

GnRH處理組雌魚(yú)在192 h取樣時(shí)，卵巢中可見(jiàn)3種類型的卵母細(xì)胞，分別為4時(shí)相、3時(shí)相、2時(shí)相，與LHRH處理組不同的是3時(shí)相卵母細(xì)胞較多。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(480 h)，卵巢中發(fā)育至4時(shí)相的卵母細(xì)胞數(shù)量急劇增加，并可見(jiàn)個(gè)別5時(shí)相卵母細(xì)胞。性腺中5時(shí)相卵母細(xì)胞比例增加明顯達(dá)20%，但僅處于5時(shí)相發(fā)育早期，不能發(fā)生水合作用而成熟。

a．2時(shí)相卵母細(xì)胞；b. 3時(shí)相卵母細(xì)胞；c.4時(shí)相卵母細(xì)胞；d. 5時(shí)相早期卵母細(xì)胞

2.4 肝細(xì)胞直徑變化

本研究發(fā)現(xiàn),對(duì)照組和自然溫光組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝細(xì)胞直徑在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未有較大變化，約為11.6～12.2 μm。LHRH處理組雌魚(yú)的肝細(xì)胞在激素誘導(dǎo)48 h后直徑增大為15.8～16.5 μm(P<0.05)，但在192 h又有所降低，至480 h最低為13.2 μm，仍然高于對(duì)照組，但同對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。GnRH處理組雌魚(yú)肝細(xì)胞直徑在192 h才開(kāi)始增大，直徑達(dá)16.4 μm，高于LHRH組的最大直徑，其后在480 h略有降低，但仍保持在15 μm以上，遠(yuǎn)高于對(duì)照組實(shí)驗(yàn)魚(yú)(P<0.05)。結(jié)果表明，外源GnRH誘導(dǎo)對(duì)肝臟細(xì)胞大小的影響較為明顯。LHRH處理組和GnRH處理組實(shí)驗(yàn)魚(yú)CF的增加與肝細(xì)胞直徑增大相對(duì)應(yīng)(圖5)。

圖5 激素誘導(dǎo)后肝臟細(xì)胞直徑的變化Fig.5 The cChanges in of hepatocytes diameter after exogenous hormones treatment

3 討 論

本研究首次利用外源激素誘導(dǎo)方法，探討了外源激素GnRH和LHRH對(duì)子一代人工二齡圓斑星鰈雌性后備親魚(yú)卵巢發(fā)育的誘導(dǎo)效果。結(jié)果表明在外源激素誘導(dǎo)下，2齡雌性親魚(yú)卵母細(xì)胞可以發(fā)育至5時(shí)相，但不能達(dá)到水合成熟，部分實(shí)驗(yàn)魚(yú)可見(jiàn)卵巢的體表隆起，但是未能獲得排卵，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)使用3齡以上的性成熟親魚(yú)。

3.1 外源激素誘導(dǎo)與內(nèi)源性激素表達(dá)水平變化的關(guān)系

本研究觀察到，在外源激素誘導(dǎo)后，圓斑星鰈血漿性類固醇激素表達(dá)水平先是顯著升高而后顯著下降，表明外源激素影響了內(nèi)源性類固醇激素的合成和分泌[10]。利用外源緩釋激素GnRH對(duì)塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)2 齡雌性親魚(yú)進(jìn)行成熟誘導(dǎo)，結(jié)果表明激素誘導(dǎo)后 1 d內(nèi)，親魚(yú)血漿性類固醇激素表達(dá)水平在短時(shí)間內(nèi)(6 h)迅速升高至峰值并在隨后下降至與對(duì)照組類似水平，睪酮出現(xiàn)峰值的時(shí)間晚于雌二醇[13]，這與本研究結(jié)果類似。在其它海水硬骨魚(yú)類如大西洋鰈(Pleuronectesferrugineus)[14]、金眼狼鱸(Moronechrysops)[6]和條紋婢魚(yú) (Latrislineata)[15]、扁海鰈(Pleuronectesplatessa)中也存在相同趨勢(shì)的血漿性類固醇激素表達(dá)變化[16]。人為操作的壓力可能也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)的血漿性類固醇激素表達(dá)水平起到抑制作用[17]，在綠背菱鲆(Phombosoleatapirina)中，實(shí)驗(yàn)過(guò)程的注射采樣操作和日常培育操作會(huì)對(duì)親魚(yú)血漿性類固醇激素表達(dá)水平帶來(lái)抑制效應(yīng)[18]。

3.2 外源激素誘導(dǎo)方式與性腺發(fā)育的關(guān)系

本研究采用兩次重復(fù)注射外源激素的方式誘導(dǎo)圓斑星鰈雌性親魚(yú)性腺發(fā)育成熟，雖然可促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育至Ⅴ期早期，但是不能達(dá)到水合成熟而排放，也未能觀察到親魚(yú)的排卵。以往研究證明，對(duì)海水硬骨魚(yú)類進(jìn)行外源激素誘導(dǎo)成熟產(chǎn)卵，單次的注射誘導(dǎo)與多次注射誘導(dǎo)及緩釋埋植激素誘導(dǎo)的效果存在較大差異，以單次注射誘導(dǎo)的效果最差，多次注射誘導(dǎo)相對(duì)較好，但是多次重復(fù)操作可能會(huì)對(duì)親魚(yú)造成生殖脅迫[8]。另外，注射法將激素注入魚(yú)體后，激素在魚(yú)體代謝系統(tǒng)內(nèi)的消除時(shí)間(持續(xù)有效時(shí)間)相對(duì)較短，如在塞內(nèi)加爾鰨中，采用注射GnRH的方法誘導(dǎo)親魚(yú)成熟，血漿中GnRH在3 d后已消除，無(wú)法檢測(cè)到[13]，在美洲鰈(Pleuronectesamericanus)中為 3 d[19]，而在細(xì)點(diǎn)牙鯛(Dentexdentex)中僅為24 h[20]。本研究的親魚(yú)最終成熟和排卵的失敗也可能與采用的注射方法有關(guān)，外源激素進(jìn)入魚(yú)體后被魚(yú)體自身內(nèi)分泌系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)快速消解。與注射法相比較，目前最為常用的是激素的緩釋系統(tǒng)，植入魚(yú)體內(nèi)后可較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)釋放GnRH，如采用緩釋系統(tǒng)誘導(dǎo)大西洋擬庸鰈(Hippoglossushippoglossus)性腺成熟產(chǎn)卵，血漿中GnRH可在1個(gè)月內(nèi)保持較高水平[21]，而細(xì)點(diǎn)牙鯛(Dentexdentex)接受外源激素埋植處理后血漿性激素水平可在24 d內(nèi)保持較高水平[20]，而且對(duì)親魚(yú)生殖脅迫小，親魚(yú)的產(chǎn)卵效果較注射法或個(gè)別自然產(chǎn)卵為好。另外，對(duì)于尚未達(dá)到生理性成熟的人工親魚(yú)，采用緩釋系統(tǒng)埋植外源激素可誘導(dǎo)性腺成熟排卵，如利用以共聚物作為緩釋載體的GnRH可誘導(dǎo)未性成熟的真鯛(Pagrusmajor)達(dá)到性成熟并排卵[22]，對(duì)美洲鰈未性成熟親魚(yú)采用外源激素誘導(dǎo)，可促進(jìn)性腺發(fā)育成熟的進(jìn)程，同時(shí)血漿性類固醇激素激素出現(xiàn)于本研究類似的表達(dá)水平變化，這對(duì)于了解其在人工養(yǎng)殖條件下的繁殖生物學(xué)特性和周年產(chǎn)卵調(diào)控具有重要的應(yīng)用價(jià)值[23]。盡管多數(shù)研究表明，外源激素進(jìn)入魚(yú)體后的消解期長(zhǎng)短因?yàn)槁裰梅椒ê蛣┝俊Ⅳ~(yú)種代謝水平、水溫的不同而差異較大[24]，但是實(shí)踐結(jié)果已證明采用緩釋系統(tǒng)對(duì)于解決人工養(yǎng)殖魚(yú)類的生殖功能障礙和成功誘導(dǎo)產(chǎn)卵較注射法更為可行。在即將開(kāi)展的下一步研究中，筆者將采用緩釋系統(tǒng)繼續(xù)開(kāi)展外源激素對(duì)親魚(yú)的誘導(dǎo)成熟產(chǎn)卵研究，另外結(jié)合溫光調(diào)控促熟措施，以比較這幾種方法的效果及緩釋系統(tǒng)能夠并成功獲得卵母細(xì)胞的水合成熟及產(chǎn)卵。

由于不同的激素在促進(jìn)硬骨魚(yú)類性腺發(fā)育成熟方面的效能差別較大且具有種的特異性，因此研究者針對(duì)不同的魚(yú)種選擇使用不同種類的激素[25]。目前，在已經(jīng)研究過(guò)的魚(yú)種和激素種類中，GnRH被認(rèn)為是最有效的外源激素，另外LHRH和HCG因?yàn)楂@取相對(duì)容易且價(jià)格相對(duì)低廉也在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域較為廣泛的使用。本研究表明，對(duì)于圓斑星鰈，GnRH和LHRH的誘導(dǎo)成熟的效果類似，未有太大區(qū)別，這可能與圓斑星鰈本身的生殖內(nèi)分泌特性有關(guān)。

3.3 外源激素誘導(dǎo)與卵巢及肝臟組織學(xué)特征變化的關(guān)系

本研究未能獲得雌性親魚(yú)卵巢中卵母細(xì)胞的完全水合成熟和排卵，但是經(jīng)激素誘導(dǎo)后，卵巢中卵母細(xì)胞組成發(fā)生明顯變化，兩種外源激素處理的親魚(yú)卵母細(xì)胞都可以達(dá)到5時(shí)相早期，表明外源激素可能通過(guò)腦-下丘腦-性腺(BPG)軸促進(jìn)了卵巢發(fā)育，同時(shí)GSI值的增加也驗(yàn)證了雌魚(yú)卵巢的發(fā)育。

研究表明，肝臟是魚(yú)類脂肪和能量的重要儲(chǔ)備基地并與產(chǎn)卵進(jìn)程密切相關(guān)[12]，但目前尚未有明確報(bào)道證實(shí)肝臟體積的變化與雌魚(yú)卵巢發(fā)育的關(guān)系。本研究觀察到激素誘導(dǎo)后，圓斑星鰈2齡雌魚(yú)HSI增加，肝細(xì)胞直徑增大，這些特征與其它一些硬骨魚(yú)類在繁殖過(guò)程表達(dá)出的特征變化相似。這些變化都間接表明，外源激素誘導(dǎo)下肝臟可能通過(guò)卵黃蛋白原的合成和傳遞作用參與了卵母細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] WADA T, MITSUNAGA N, SUZUKI H, et al. Growth and habitat of spotted halibutVeraspervariegatusin the shallow coastal nursery area, Shimabara Peninsula in Ariake Bay, Japan [J]. Fisheries Science, 2006, 72: 603-611.

[2] DOU S Z. Food utilization of adult flatfishes co-occurring in the Bohai Sea of China [J]. Netherlands Journal of Sea Research, 1995, 34 (1-3): 183-193.

[3] BAEK H J, KIM Y, AN C M, et al. Effects of hormonal treatment on induced maturation and ovulation in the spotted halibut,Veraspervariegatus[J]. Journal of Aquaculture, 2000, 13(1): 47-53.

[4] DEN J Y, MENG T X, REN S M, et al. Species composition, abundance and distribution of fishes in the Bohai Bay [J]. Marine Fisheries Research, 1988, 9: 10-98. 鄧景耀, 孟田湘, 任勝民, 等.渤海魚(yú)類種類組成及數(shù)量分布[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 1988, 9: 10-98.

[5] DAHLE R, TARANGER G L, KARLSEN ?, et al. Gonadal development and associated changes in liver size and sexual steroids during the reproductive cycle of captive male and female Atlantic cod (GadusmorhuaL.) [J]. Comp. Biochem. Physol.A. Mol. Integr. Physiol., 2003, 136(3): 641-653.

[6] MYLONAS C C, SCOTT A P, VERMEIRSSEN E L, et al. Changes in plasma gonadotropin II and sex-steroid hormones, and sperm production of striped bass after treatment with controlled-release gonadotropin-releasing hormone agonist delivery systems[J]. Biol. Reprod.,1997, 57:669-675.

[7] KOMATSU T, BHANDARI R K, KOBAYASHI Y, et al. GnRHa-accelerated spermatogenesis in the testes of underyearling golden rabbitfish,Siganusguttatus(Bloch) [J]. Aquaculture, 2006, 257: 558-565.

[8] ZOHAR Y, MYLONAS C C. Endocrine manipulations of spawning in cultured fish: from hormones to genes[J]. Aquaculture, 2001, 197: 99 136.

[9] ANDO M, NIHO H, TSUKAMASA Y, et al. Valuation of cultured spotted halibutVeraspervariegatusby comparing with cultured plaice Paralichthys olivaceus[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 1998, 64(6):1027-1033.

[10] MYLONAS C C, ZOHAR Y. Use of GnRHa-delivery systems for the control of reproduction in fish [J]. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 2000, 10(4): 463-491.

[11] XU Y J, LIU X Z, LIU J G, et al. Histological and morphometric studies on the annual gonadal maturation cycle of spotted halibutVeraspervariegatus[J]. Progress in Fishery Sciences, 2011, 32(3): 7-15. 徐永江, 柳學(xué)周, 劉君剛, 等.圓斑星鰈卵巢發(fā)育的組織學(xué)和數(shù)量形態(tài)特征研究[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2011, 32(3): 7-15.

[12] KJESBU O S. A simple method for determining the maturity stages of Northeast Arctic cod (Gadus morhua L.) by in vitro examination of oocytes [J]. Sarsia, 1991,75: 335-338.

[13] GUZMAN J M, RAMOS J, MYLONAS C C, et al. Spawning performance and plasma levels of GnRHa and sex steroids in cultured female Senegalese sole (Soleasenegalensis) treated with different GnRHa-delivery systems[J]. Aquaculture, 2009, 291 (3-4): 200-209.

[14] LARSSON D G J, MYLONAS C C, ZOHAR Y, et al. Gonadotropin releasing hormone-analogue (GnRH-A) advances ovulation and improves the reproductive performance of a cold-water batch-spawning teleost, the yellowtail flounder (Pleuronectesferrugineus)[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1997, 54: 1957-1964.

[15] MOREHEAD D T, PANKHURST N W, RITAR A J. Effect of treatment with LHRH analogue on oocyte maturation, plasma sex steroid levels and egg production in female striped trumpeterLatrislineata(Latrididae)[J]. Aquaculture, 1998, 169: 315-331.

[16] SCOTT A P, WITTHAMES P R, VERMEIRSSEN E L M, et al. Prolonged-release gonadotrophin-releasing hormone analogue implants enhance oocyte final maturation and ovulation, and increase plasma concentrations of sulfated C21steroids in North Sea plaice [J]. Journal of Fish Biology, 1999, 55: 316-328.

[17] PANKHURST N W, VAN D K G. Effects of stress on reproduction and growth of fish. Fish stress and health in aquaculture. Society for Experimental Biology Seminar Series 62[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 1997: 73-93.

[18] BARNET C W, PANHURST N W. The effects of commom laboratory and husbandry practices on the stress response of greenback flounderRhombosoleatapirina(Günther, 1862) [J]. Aquaculture, 1998, 162: 313-329.

[19] HARMIN S A, CRIM L W. Influence of gonadotropin hormone-releasing hormone analog (GnRH-A) on plasma sex steroid profiles and milt production in male winter flounder,Pseudopleuronectesamericanus(Walbaum) [J]. Fish Physiol. Biochem., 1993, 10: 399-407.

[20] GREENWOOD L N, SCOTT A P, VERMEIRSSEN E L, et al. Plasma steroids in mature common dentex (Dentexdentex) stimulated with a gonadotropin-releasing hormone agonist [J]. Gen. Comp. Endocrinol., 2001, 123:1-12.

[21] VERMEIRSSEN R L M, SHILEDS R J, MAZORRA Q C, et al. Gonadotropin-releasing hormone agonist raises plasma concentrations of progestogens and enhances milt fluidity in male Atlantic halibut (Hippoglossushippoglossus) [J]. Fish, Physiol. Biochem., 2000, 22: 77-87.

[22] MATSUYAMA M, HAMADA M, ASHITANT T, et al. Development of LHRH-a copolymer pellet polymerized by ultraviolet and its application for maturation in red sea breamPagrusmajorduring the non-spawning season [J]. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish, 1993, 59(8):1361-1369.

[23] HARMIN S A, CRIM L W, WIEGAND M D. Manipulation of the seasonal reproductive cycle in winter flounder,Pleuronectesamericanus, using a gonadotropic hormone releasing hormone [J]. Marine Biology, 1995, 121: 611-619.

[24] KING H R, PANKHURST N W. Effect of maintenance at elevated temperatures on ovulation and luteinizing hormone releasing hormone analogue responsiveness of female Atlantic salmon (Salmosalar) in Tasmania [J]. Aquaculture, 2004, 223: 583-597.

[25] POORTENAAR C W, PANHURST N W. Effect of Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue and Human Chorionic Gonadotropin on Ovulation, Plasma and Ovarian Levels of Gonadal Steroids in Greenback FlounderRhombosoleatapirina[J]. Journal of the World Aquaculture Society, 2000, 31(2): 175-186.