趙惠婭，劉同軍，鄭風(fēng)榮，林學(xué)政*

(1. 山東輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，山東 濟南 250353；2. 國家海洋局第一海洋研究所 國家海洋局海洋生物活力物質(zhì)重點實驗室，山東 青島 266061)

微生物多糖種類眾多，包括胞內(nèi)多糖、結(jié)構(gòu)多糖、胞外多糖等, 目前研究的熱點集中于微生物胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)。EPS是微生物的次級代謝產(chǎn)物，是微生物在生長過程中分泌到細胞壁外形成與菌體分離的可溶性多糖及多糖復(fù)合物[1]。EPS在細胞外形成一層薄膜，可有效地防止外界環(huán)境變化和侵蝕者對菌體細胞的侵害，從而提高自身的防御能力[2]。南極獨特的地理和氣候條件，形成了一個低溫、干燥、強輻射的極端環(huán)境，而在此環(huán)境中生存著大量可產(chǎn)胞外多糖的微生物菌群。這些極端環(huán)境中產(chǎn)生的微生物胞外多糖由于其獨特的分子結(jié)構(gòu)與物理化學(xué)性質(zhì)，使其在制藥、食品添加劑等方面具有廣闊的市場前景[3]。

微生物多糖能夠增強動物對細菌、真菌、病毒等的抵抗力，增強動物對外界不良刺激的反應(yīng)，提高動物的免疫能力[4]。近年來，我國水產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，盡管抗生素的使用可以使許多疾病得以控制，但是卻對環(huán)境和水產(chǎn)品品質(zhì)造成嚴(yán)重的不良影響。微生物多糖無藥劑殘留，且能改善動物健康狀況，改善水體微生態(tài)環(huán)境，提高經(jīng)濟利益，因而受到人們的重視[5]。李桂峰等[6]將酵母多糖作為飼料添加劑投喂赤眼鱒后，發(fā)現(xiàn)其血清SOD酶活力、溶菌酶活力等均有不同程度的提高。Skov等[7]將β-1,3-葡聚糖結(jié)合到治療Yersiniaruckeri引起的虹口病疫苗中，研究其對虹鱒魚的免疫作用，發(fā)現(xiàn)在含有β-1,3-葡聚糖的魚血漿中溶菌酶活力具有增加趨勢。張路等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加500 mg/kg肽聚糖時，可顯著提高鱸魚白細胞的吞噬指數(shù)和血清中溶菌酶活力。

極地特殊的生存環(huán)境使極地微生物在基因組成、酶學(xué)特點、代謝調(diào)節(jié)等方面具有獨特的生物學(xué)機制與生理生化特性[9]，其產(chǎn)生的胞外多糖較一般微生物多糖更具有獨特的生物學(xué)活性[10]。有關(guān)極地胞外多糖在水產(chǎn)動物免疫系統(tǒng)的作用及在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用目前尚未見報道，因此研究其作用具有重要意義和應(yīng)用潛力。

本研究從600余株分離自南極微生物中篩選出10株產(chǎn)胞外多糖較高的菌株，對其進行分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析；并對其中4種多糖進行了大菱鲆非特異性免疫活力實驗，從中篩選出2株可產(chǎn)生顯著提高大菱鲆(Scophthalmusmaacimus)免疫活性的胞外多糖的極地菌株，以期為研發(fā)EPS免疫添加劑打下一定的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材 料

菌株：由國家海洋局第一海洋研究所海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室菌種庫提供。

大菱鲆(Psettamaxima)：由威海某大菱鲆養(yǎng)殖場提供。

黃芪多糖：作為陽性對照，購自上海朝翔生物技術(shù)有限公司。

1.2 產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選與EPS的提取

采用苯酚硫酸法進行產(chǎn)胞外多糖菌株的初篩[1]，其標(biāo)準(zhǔn)曲線制備參考文獻[11]，產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選過程參考文獻[1]。

產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選操作過程：1)取100 μL菌液接種到5 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，10 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)5 d；2)1 mL 發(fā)酵液經(jīng)離心后取0.5 mL上清液，加入1.5 mL 95%乙醇，4 ℃靜置4 h；3)再次離心取沉淀，將沉淀溶于1 mL蒸餾水中，采取苯酚硫酸法測其多糖含量；4)根據(jù)490 nm吸光值，篩選出10株產(chǎn)胞外多糖較高的菌株。

根據(jù)篩選結(jié)果，對其中產(chǎn)胞外多糖較高的菌株的復(fù)篩參考文獻[12]，具體流程為：1)將發(fā)酵液以7 500 r/min離心10 min，除去菌體；2)取出上清液，加入3倍上清液體積的95%乙醇靜置沉淀4 h；3)以7 500 r/min離心10 min，倒掉上清液，用去離子水溶解沉淀的多糖；4)采用Sevag法除蛋白，以7 500 r/min離心5 min; 5)取上清，加入3倍上清液體積的95%乙醇沉淀，以7 500 r/min離心10 min；6)用去離子水溶解沉淀的多糖，冷凍干燥，獲得粗多糖。

1.3 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rRNA基因擴增中的DNA模板的制備和PCR引物選取參照文獻[13]進行。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共進行30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物股份有限公司進行純化和測序。將所測定的16S rRNA基因序列同GenBank數(shù)據(jù)庫已有細菌16S rRNA基因序列進行相似性比較分析。

序列比對采用BioEdit軟件的多序列比對排列(Clustalw multiple alignment)，系統(tǒng)發(fā)育分析采用Mega 4.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining method)。

1.4EPS對大菱鲆的非特異性免疫實驗

選擇體重(100 ± 5) g、體長(12 ± 0.6) cm、體色基本一致的健康大菱鲆，隨機分養(yǎng)于水族箱中，適應(yīng)馴化1周后，開始實驗。實驗中采用水溫15～18 ℃海水，每天早晨8:00喂食、10:00換水排污。實驗時，將魚隨機分為9組，每組15尾，每組處理2個重復(fù)。

1.4.1 注射劑量與方法

用pH 7.4的滅菌PBS緩沖液配制多糖試劑，濃度為3 mg/mL。對照組肌肉注射0.1 mL PBS緩沖液、實驗組肌肉注射0.1 mL多糖溶液、陽性對照組注射0.1 mL黃芪多糖。

1.4.2 血清的制備

注射3 d、5 d、7 d時，每尾魚從尾靜脈取血1 mL，4 ℃靜置過夜，第二天取血清，2 000 r/min離心5 min，取上清液測定各酶活性。

1.4.3 免疫指標(biāo)的測定

總超氧化物歧化酶(total super oxide dismutase, T-SOD)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、酸性磷酸酶(acd phosphatase, ACP)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和溶菌酶(lysozyme, LSZ)活力的測定均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒產(chǎn)品，并參照試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選

將經(jīng)初篩獲得的10株胞外多糖高產(chǎn)菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)醇沉、sevage法除蛋白后，冷凍干燥所得的粗多糖稱重結(jié)果見圖1?？梢钥闯?，10株菌株產(chǎn)生的EPS絕大多數(shù)均高于0.2 g/L，其中菌株3-3-1-2胞外粗多糖產(chǎn)量高達0.6 g/L。

圖1產(chǎn)胞外多糖菌株篩選Fig.1 Screening of exopolysaccharide-producing bacteria strains

2.2 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

將10株高產(chǎn)胞外多糖菌株的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫已有序列進行比對分析，與篩選出的菌株相似度最高的模式菌株如表1所示。將測序得到的基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列注冊號為JX262364～JX262373(表1)。

表1 產(chǎn)胞外多糖菌株16S rRNA基因序列同源性比較結(jié)果Table 1 Homology comparison of 16S rRNA sequence of exopolysaccharide-producing bacteria strains

一般認(rèn)為，16S rRNA基因序列同源性小于98%屬于不同的種，同源性小于93%(95%屬于不同的屬[14]。由表1可知，篩選出的高產(chǎn)胞外多糖的菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列相似度均在99%以上。除菌株4-1-9-1、4-3-1、185的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫已有細菌基因序列介于99.85%(99.92%外，其它菌株的相似度均為100%。因此，在進行系統(tǒng)發(fā)育分析時分別選擇具有代表性的菌株進行研究，構(gòu)建的高產(chǎn)胞外多糖菌株及其相似度最高的模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2產(chǎn)胞外多糖菌株系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of exopolysaccharide-producing bacteria strains

由圖2可知，篩選出的10株高產(chǎn)胞外多糖菌株中，除菌株4-3-1屬于嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)外，其余9株均屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)。

2.3 粗多糖對大菱鲆非特異性免疫活力指標(biāo)的影響

2.3.1 粗多糖對大菱鲆血清AKP活力的影響

4種極地微生物EPS與黃芪多糖對大菱鲆血清AKP活力的影響見表2。注射實驗的粗多糖均可不同程度地提高大菱鲆血清AKP活力，且同一實驗組AKP活力隨注射時間的增加而呈下降趨勢。實驗第3天時，注射多糖20#3、DY2-2、3-3-1-2的實驗組比對照組分別增加了39%、36%、12%；其中20#3、DY2-2實驗組差異顯著(P<0.05)，3-3-1-2實驗組差異不顯著(P>0.05)。20#3、DY2-2實驗組的大菱鲆血清AKP活力高于陽性對照黃芪多糖實驗組。實驗第5天時，注射多糖20#3實驗組比PBS對照組增加了21%，比陽性對照黃芪多糖組增加了8%，但差異并不顯著(P>0.05)。綜合實驗結(jié)果表明，多糖20#3、DY2-2對大菱鲆血清AKP活力的促進作用較強。

2.3.2 粗多糖對大菱鲆血清ACP活力的影響

4種極地微生物EPS與黃芪多糖對大菱鲆血清ACP活力的影響見表3。注射實驗的粗多糖對大菱鲆血清ACP活力均有一定程度的影響，同一實驗組ACP活力隨著注射時間的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢。實驗第5天時，注射多糖20#3、DY2-2、3-3-1-2、4-6-8-1的實驗組比對照組活力分別增加了20%、13%、24%、7%，其中注射多糖20#3和3-3-1-2實驗組差異顯著(P<0.05)，其他各實驗組差異不顯著(P>0.05)。由多糖對大菱鲆ACP活性影響趨勢可知，其最佳作用時間在第5天。實驗第5天，實驗組與黃芪多糖陽性實驗組對比可知，對大菱鲆血清ACP活力影響效果較好實驗組多糖為20#3、3-3-1-2。

表2 各組AKP酶活力(king·100 mL-1)Table 2 The AKP activity in different test groups (king·100 mL-1)

注：a為差異顯著(P<0.05)

表3 各組ACP酶活力(U·100 mL-1)Table 3 The ACP activity in different test groups (U·100 mL-1)

注：a為差異顯著(P<0.05)

2.3.3 粗多糖對大菱鲆血清T-SOD活力的影響

4種極地微生物EPS與黃芪多糖對大菱鲆血清T-SOD活力的影響見表4。注射實驗的粗多糖均可不同程度地提高大菱鲆血清T-SOD活力，且同一實驗組T-SOD活力隨注射時間的增加而呈下降趨勢。注射多糖20#3、DY2-2、3-3-1-2實驗組第3天時的T-SOD活力比對照組增加了13%、10%、7%，第5天時的T-SOD活力比對照組增加了14%、13%、7%，其中20#3、DY2-2實驗組差異極顯著(P<0.01)，3-3-1-2實驗組差異顯著(P<0.05)。第3天時，20#3、DY2-2實驗組的T-SOD活力比黃芪多糖陽性實驗組分別高8%、5%。綜合實驗結(jié)果可知，對大菱鲆血清T-SOD活力影響顯著的多糖為：20#3、DY2-2。

表4 各組T-SOD酶活力(U·mL-1)Table 4 The T-SOD activity in different test groups (U·mL-1)

注：a為差異顯著(P<0.05)，b為差異極其顯著(P<0.01)

2.3.4 粗多糖對大菱鲆血清CAT活力的影響

4種極地微生物EPS與黃芪多糖對大菱鲆血清CAT活力的影響見表5。注射實驗的粗多糖均可不同程度地提高大菱鲆血清CAT活力，且同一實驗組CAT活力隨注射時間的增加而呈下降趨勢。多糖注射3 d時，注射多糖20#3、4-6-8-1實驗組比PBS對照組分別增加24%、18%，且差異顯著(P<0.05)；5 d時，注射實驗多糖的實驗組均比PBS對照組活性有所增加，其中4-6-8-1實驗組差異極顯著(P<0.01)，注射其它多糖實驗組差異顯著(P<0.05)。20#3、3-3-1-2、4-6-8-1實驗組在注射5 d時的CAT酶活力比黃芪多糖陽性對照組分別增加了8%、5%、13%，由實驗組7 d時的CAT酶活力均比黃芪多糖陽性對照組高。綜合實驗結(jié)果，對大菱鲆血清CAT影響顯著的胞外多糖為20#3、4-6-8-1。

表5 各組CAT酶活力(U·mL-1)Table 5 The CAT activity in different test groups (U·mL-1)

注：a為差異顯著(P<0.05),b為差異極顯著(P<0.01)

2.3.5 粗多糖對大菱鲆LSZ活力的影響

4種極地微生物EPS與黃芪多糖對大菱鲆血清CAT活力的影響見表6。注射不同種類的粗多糖對大菱鲆血清LSZ活力影響不一。試驗期間，所有胞外多糖對大菱鲆血清溶菌酶活力影響顯著(P<0.05)。其中多糖3-3-1-2、4-6-8-1在整個試驗期間其溶菌酶活力變化緩慢，與PBS對照組溶菌酶活力差異極顯著(P<0.01)。實驗第5、7天時，多糖3-3-1-2、4-6-8-1實驗組的溶菌酶活力均比黃芪多糖陽性對照組高。綜合實驗結(jié)果可知，對大菱鲆血清CAT影響顯著的胞外多糖為3-3-1-2、4-6-8-1。

表6 各組LSZ酶活力(μg·mL-1)Table 6 The LSZ activity in different test groups (μg·mL-1)

注：a為差異顯著(P<0.05)，b為差異極顯著(P<0.01)

2.3.6 粗胞外多糖對大菱鲆非特異性免疫指標(biāo)結(jié)果匯總

由表2～6可知，各粗多糖在不同程度上可提高大菱鲆血清中AKP、ACP、T-SOD、CAT、LSZ等酶活力。將4種胞外多糖的選取指標(biāo)進行匯總，選取各指標(biāo)促進效果較好的前2種EPS，結(jié)果見表7。

表7 粗多糖活性篩選結(jié)果匯總表Table 7 The summary table of rescreening of crude EPSs

注:+——效果差異顯著;△——相同模式菌株；☆——相同模式菌株

由表7可知，在活性實驗中的5個酶活指標(biāo)中，菌株20#3產(chǎn)的EPS有4個指標(biāo)較好；菌株DY2-2、3-3-1-2、4-6-8-1產(chǎn)的EPS均有2個指標(biāo)較好，因而首先選取菌珠20#3產(chǎn)生的EPS進行進一步研究。此外，由于菌株4-6-8-1與菌株20#3是相同的模式菌株，因此舍去該菌株；菌株DY2-2、3-3-1-2的模式菌株相同，但是菌株3-3-1-2的EPS產(chǎn)量高于DY2-2，因此選取菌株3-3-1-2作為進一步研究對象。綜合EPS對大菱鲆血清酶活的影響、EPS產(chǎn)量、菌株種屬三方面因素，最終選定菌株20#3和3-3-1-2進行下一步研究。

3 討 論

活性多糖是一種免疫增強劑，能夠增強水產(chǎn)動物的非特異性免疫功能，提高機體抗病能力，且具有無污染、無藥物殘留等優(yōu)點，因此日漸受到人們的重視[15]。目前采用較多的多糖免疫增強劑有β-葡聚糖、脂多糖、海藻多糖、肽聚糖等。我國眾多研究者在評價免疫刺激劑對水產(chǎn)動物免疫系統(tǒng)的刺激效果時，常用的指標(biāo)包含特異性免疫和非特異性免疫兩方面，而一般研究者主要研究水產(chǎn)動物的非特異性免疫，其中非特異性免疫的指標(biāo)包含AKP、ACP、T-SOD、PO等[16]。在本研究中將ACP、AKP、T-SOD、CAT、LSZ作為大菱鲆的非特異性免疫指標(biāo)。研究結(jié)果初步證實，對大菱鲆注射極地微生物EPS均能不同程度地提高其非特異免疫活力，但是其促進程度存在者一定的差異。

本研究結(jié)果表明，在整個實驗期間同一組大菱鲆血清AKP活力隨著注射時間的增加而呈遞減趨勢，第3天時酶活力最高，而在第5、7天時有所降低，這與張偉妮等[17]的研究結(jié)果不同。同一實驗組ACP活力隨著注射時間的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，這與王慶奎等[18]的研究結(jié)果相似。極地微生物EPS可以不同程度地增加大菱鲆血清中T-SOD的活力，且增加效果明顯，但隨著注射時間的增加，同一實驗組T-SOD的活力呈降低趨勢，這與許國煥等[19]的研究結(jié)果相似。整個實驗期間，大菱鲆血清CAT活力變化顯著，同一實驗組CAT活力隨著注射時間的增長呈顯著降低趨勢，這與黃玉章[20]的實驗結(jié)果相似。LSZ活力在整個試驗期間差異顯著，4種多胞外糖在較大程度上提高了大菱鲆的LSZ活力，且其作用時間較其它指標(biāo)久，該實驗結(jié)果與汪曉路等[21]的實驗結(jié)果相似。造成這些酶活力結(jié)果差異的原因可能與選取的實驗動物及多糖自身性質(zhì)有關(guān)[17]。綜合胞外多糖產(chǎn)量、種屬、免疫活性活性等多重條件，最終選定最佳菌株為20#3、3-3-1-2。

目前，免疫添加劑在對蝦的免疫活性方面的研究比較多。How等[22-24]在凡納濱對蝦的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向?qū)ξr體內(nèi)注射4～6μg/g 的海藻多糖時，其血細胞中的THC、SOD、PO等活力在1～2 d 內(nèi)會有不同程度的提高，6 d 時回落到對照組水平。Yeh等[22]向?qū)ξr體內(nèi)注射10～50 μg/g 的葉馬尾藻提取物時發(fā)現(xiàn)，其THC、PO等活力可持續(xù)6 d，而Cheng等[25]通過研究褐藻酸鈉在對蝦免疫活力方面的作用發(fā)現(xiàn)，其PO、O-2活力只能持續(xù)到第4天，在第6天時，各個指標(biāo)均回落到對照組水平。以上結(jié)果表明，采用注射方法可在1～6 d內(nèi)對機體保持免疫保護作用。本實驗采用肌肉注射法并測定了極地微生物EPS對大菱鲆血清酶活的影響，實驗結(jié)果表明，在注射多糖第5天時，多種酶活達到最大活力，第7天時，各指標(biāo)均有不同程度的回落，這與cheng等[25]的實驗結(jié)果相一致。

王淑嫻等[26]在研究茯苓多糖對刺參的影響中發(fā)現(xiàn)注射0.3 mg茯苓多糖時，AKP和LSZ活力較高，而注射0.5 mg茯苓多糖時SOD的活力較高，可見注射多糖濃度的不同會對免疫指標(biāo)的活力造成一定的影響。許第新等[16]在研究免疫多糖對克氏原螯蝦的研究中發(fā)現(xiàn)，在注射多糖后，其血清、肌肉、肝臟等不同部位的AKP等酶活力不同，且其變化規(guī)律也具有一定的差異。由此可知，多糖對同一生物不同組織器官的影響各不相同。由于本實驗只是粗篩具有免疫活性的極地微生物胞外多糖，因此只測定了單一濃度對大菱鲆血清中酶免疫指標(biāo)活力的影響。

目前對適冷菌產(chǎn)生的胞外多糖研究也較多。Bai等[27]從南極細菌Pseudoaltermonassp.S-5中分離到一種胞外多糖PEP，通過研究其對白細胞免疫活力的影響，發(fā)現(xiàn)其是一種很好的天然生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。周維芝等[28]從南極海冰細菌Pseudoalteromonassp. Bsi20310中提取胞外多糖，發(fā)現(xiàn)其可以明顯改善鐵鹽對模擬水溶性染料活力艷紅X-3B廢水的混凝效果。秦國奎等[29]從深海適冷菌Pseudoalteromonassp. SM9913中分離得到胞外多糖，研究發(fā)現(xiàn)其對于適冷菌在深海低溫環(huán)境中維持細胞結(jié)構(gòu)的完整和酶構(gòu)象穩(wěn)定方面具有重要的生態(tài)學(xué)功能。李江等[30]從南極適冷菌Pseudoalteromonassp. S-15-13中分離純化到胞外多糖組分EPS-Ⅱ，對其研究發(fā)現(xiàn)胞外多糖組分EPS-Ⅱ可以抑制小鼠增殖細胞核抗原PCNA的表達，有效抑制小鼠腫瘤生長，最高抑瘤率可達45.1%。由此可見南極適冷菌產(chǎn)生的胞外多糖具有很好的生物學(xué)活性。目前生物活性多糖如云芝多糖、海藻多糖、葡聚糖等在羅氏沼蝦、南美白對蝦、虹鱒魚等水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中均能發(fā)揮提高免疫活力、促進生長、提高存活率的作用，且環(huán)保無公害，是一種具有很大市場潛力、用途廣泛的水產(chǎn)動物飼料添加劑[31]。而目前國內(nèi)對于極地微生物胞外多糖作為免疫添加劑的研究尚未見報道，因此研究具有特殊活性的極地菌胞外多糖具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究采用苯酚硫酸法和醇沉法從600余株南極微生物中篩選得到了10株產(chǎn)胞外多糖較高的菌株，其中菌株3-3-1-2粗胞外多糖產(chǎn)量達0.6 g/L。分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析可知，10株高產(chǎn)胞外多糖的極地微生物中9株屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)，1株屬于嗜冷桿菌屬 (Psychrobacter)。根據(jù)胞外多糖粗提結(jié)果選擇4種粗胞外多糖進行了大菱鲆非特異性免疫活性實驗，篩選出2株可產(chǎn)生顯著提高大菱鲆免疫活性的胞外多糖的極地菌株20#3和3-3-1-2，為極地胞外多糖作為水產(chǎn)動物飼料添加劑提供一定的基礎(chǔ)資料。

參考文獻(References)：

[1] LIU T H, LI L L, QIAO M. Screening and identification of marine bacteria with exocellular polysaccharide[J]. Journal of Shandong Normal University(Natural Science, 2011,26(2):122-124.劉天華,李樂樂,喬夢.產(chǎn)胞外多糖海洋細菌的篩選及鑒定[J].山東師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,26(2):122-124.

[2] Kumar A S, Mody K, Jha B. Bacterial exopolysaccharides-a perception[J].Journal of Basic Microbiology,2007,47:103-107.

[3] Poli A, Anzelmo G, Nicolaus B. Bacterial exopolysaccharides from extreme marine habitats: production , characterization and biological activities[J]. Mar Drugs, 2010,8(6):1779-1802.

[4] XIE L P.Immune enhancing effects of exopolysaccharides on the breeding animals[J].Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Fujian, 2006,28(1):53-54.謝荔朋.微生物胞外多糖對養(yǎng)殖動物的免疫增強作用[J].福建畜牧獸醫(yī),2006,28(1):53-54.

[5] MA H Y. Probiotics and its research in the aquaculture industry[J]. Veterinary Pharmaceuticals & Feed Additives, 2005,10(3):9-10.馬洪雨.微生態(tài)制劑及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用研究進展[J].獸藥與飼料添加劑,2005,10(3):9-10.

[6] LI G F , KANG Y C, SUN J J, et al. The effects of Yeast Gluean on theSqualiobarbuscurriculusnon-specific immune response[J].Acta Scientiarum Naturlium Universitatis Sunyatseni, 2003,42(4):55-58.李桂峰,康裕財,孫際佳,等.酵母多糖對赤眼鱒非特異性免疫機能的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2003,42(4):55-58.

[7] Skov J,Kania P W, Holten-Andersen L, et al.Immunomodulatory effects of dietary β-1,3-glucan fromEuglenagracilisin rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) immersion vaccinated against Yersinis ruckeri[J]. Fish & shellfish Immunology,2012,33(1):111-120.

[8] ZHANG L, AI QH, MAI KS,et al.Effects of dietary peptidoglycan level on the growth and non-specific immunity of Japanese seabass,Lateolabraxjaponcus[J].Periodical of Ocean University of China, 2008,38(4):551-556.肽聚糖對鱸魚生長和非特異性免疫力的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2008,38(4):551-556.

[9] ZENG Y X,CHEN B,ZOU Y,et al.Polar microorganisms, a potential source for new natural medicines-a review[J].Acta Microbiologica Sinica, 2008,48(5):695-700.曾胤新,陳波,鄒揚,等.極地微生物-新天然藥物的潛在來源[J].微生物學(xué)報,2008,48(5):695-700.

[10] Nichols C A, Guezennec J, Bowman J P. Bacterial exopolysaccharides from extreme marine environments with special consideration of the southern ocean, sea ice, and deep-sea hydrothermal vents: a review[J]. Mar Biotechnol(NY), 2005,7(4):253-271.

[11] ZHANG Y,LUAN X H.Screening of marine bacteria producting exopolysaccharide from sea coast[J].Modern Fisheries Information, 2010,25(4):13-17.張云,欒小惠.產(chǎn)胞外多糖的近海海洋細菌的篩選[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息,2010,25(4):13-17.

[12] AI L Z,GUO B H,WANG Y Y,et al.Extraction of exopolysaccharides fromLactobacilluscaseiLC2W[J].Chinadairy Industry, 2008,36(7):14-18.艾連中,郭本恒,王蔭榆,等.干酪乳桿菌LC2W胞外多糖的提取[J].中國乳品工業(yè),2008,36(7):14-18.

[13] DU Z J, ZHAO Y, LI M J,et al.Screening and biodiversity analysis of agarolytic bacteria in the Qingdao coast[J].Periodocal of Ocean University of China, 2007,37(2):277-282.杜宗軍,趙苑,李美菊,等.青島近海瓊膠降解細菌的篩選和多樣性分析[ J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2007,37(2):277-282.

[14] LI F,ZENG G M,FAN C Z,et al.Comparison microbial communities during high temperature period of compoating of organic agriculture wastes and municipal domestic waste[J].Microbiology,2009,36(11):1657-1663.農(nóng)業(yè)有機廢物與城市生活垃圾堆肥高溫期微生物種群結(jié)構(gòu)比較[J].微生物學(xué)通報,2009,36(11):1657-1663.

[15] SUN C C,WANG A L, WANG S F,et al.Effects of polysaccharides on aquatic animals immune[J].Marine Science Bulletin, 2003,22(3):81-88.孫翠慈,王安利,王素芬,等.活力多糖對水產(chǎn)動物免疫功能的調(diào)節(jié)[J].海洋通報,2003,22(3):81-88.

[16] XU D X,YAO J, CHEN C F.Effects of polysaccharides from the cell wall of yeast onProcambarusshrimpin several immne-related activity [J].Freshwater Fisheries, 2004,34(5):56-58.許第新,姚娟,陳昌福.注射免疫多糖(酵母細胞壁)對克氏原螯蝦幾種免疫相關(guān)酶活性的影響[J].淡水漁業(yè),2004,34(5):56-58.

[17] ZHANG W N, LIN X, WANG S K,et al.Effects of astragalus polysaccharide on nonspecific immunity and endocrine function in stomach and foregut of tilapia[J].Chinese Journal of Animal Nutrition, 2010,22(2):401-409.張偉妮,林旋,王壽昆,等.黃芪多糖對羅非魚非特異性免疫和胃腸內(nèi)分泌功能的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2010,22(2):401-409.

[18] WANG Q K, ZHAO H Y, CHEN C X, et al. Effects of pachyman polysaccharides on nonspecific immunity of epinephelus malabaricus[J]. Aquatic Feed,2011,32(14):34-36.王慶奎, 趙海運, 陳成勛, 等.茯苓多糖對點帶石斑魚非特異性免疫力的影響[J].水產(chǎn)飼料,2011,32(14):34-36.

[19] XU G Z, LIANG Y G, WU Y E,et al.Immunity effects of Yeast Glucan on P. vannamei Boone[J].Feeding Industry, 2003,24(10):53-54.許國煥,良友光,吳月嫦,等.酵母葡聚糖對南美白對蝦免疫功能的影響[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖,2003,24(10):53-54.

[20] HUANG Y Z.Effects of astragalus polysaccharides on growth performance and immunity function in tilapia[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2009.黃玉章.黃芪多糖對奧尼羅非魚生長性能和免疫功能的影響[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué),2009.

[21] JIANG X L, LIU S Q, MOU H J, et al. Effects of fesungus polysaccharose on immune activities of serum and lymphoyte ofPenaeuschinensis[J].Zoological Research,1999,20(1):41-45.江曉路,劉樹青,牟海津,等.真菌多糖對中國對蝦血清及淋巴細胞免疫活性的影響[J].動物學(xué)研究, 1999,20(1):41-45.

[22] How W Y, Chen J C. The immunostimulatory effect of hot-water extract ofGracilariatenuistipitataon the white shrimpLitopenaeusvannameiand its resistance againstVibrioalginolyticus[J]. Fish & Shellfish Immunology,2005,8(19):127-138.

[23] Yeh S T, Lee C S, Chen J C. Administration of hot-water extract of brown seaweedSargassumduplicatumvia immersion and injection enhances the immune resistance of white shrimpLitopenaeusvannamei[J].Fish & Shellfish Immunology, 2006,3(20):332-345.

[24] Fu Y W, Hou W Y, Yeh S T, et al. The immunostimulatory effects of hot-water extract ofGelidiumamansiivia immersion, injection and dietary administration on white shrimpLitopenaeusvannameiand its resistance againstVibrioalginolyticus[J]. Fish & Shellfish Immunology,2007,7(22):673-685.

[25] Cheng W, Liu C H, Yeh S T, et al. The immunestimulatory effect of sodium alginate on the white shrimpLitopenaeusvannameiand its resistance againstVibrioalginolylicus[J]. Fish & Shellfish Immunology,2004,7(17):41-51.

[26] WANG S X, LI T B, PAN Y,et al.Efeects of pachyman polysaccharides on immune factor activity in the body cavity fluid of sea cucumber[J]. Journal of Aquaculture, 2010,1:59-61.王淑嫻,李天保,樊英,等.茯苓多糖對刺參體腔液中免疫因子活性的影響[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖,2010,1:59-61.

[27] BAI Y, ZHANG P, CHEN G, et al. Macrophage immunomodulatory activity of extracellular polysaccharide (PEP) of Antarctic bacteriumPseudoaltermonassp.S-5[J]. Int Immunopharmacol,2012,12(4):611-7.

[28] ZHOU W Z, SHEN B L, LIU S B,et al.FTIR spectrum and coagulation enhancement of exopolysaccharide secreted by an Antarctica bacterium Pseudoalteromona sp. Bsi20310[J].Spectroscopy and Spectral Analysis, 2009,29(9):2405-2408.周維芝,申博玲,劉升波,等.南極海冰細菌胞外多糖的助凝作用及紅外光譜分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2009,29(9):2405-2408.

[29] QIN G K.Structure,ecological roles and biosynthesis gene cluster of EPS from deep-sea psychrotrophic bacteriumPseudoalteromonassp.SM9913[D]. Jinan: Shandong University, 2007. 秦國奎.深海適冷菌Pseudoalteromonassp.SM9913 分泌的胞外多糖的結(jié)構(gòu)鑒定生態(tài)學(xué)功能及其生物合成基因簇的克隆與分析[D].濟南：山東大學(xué),2007.

[30] LI J, CHEN K S, LI G Y,et al.Inhibitory effects of exopolysaccharide(EPS) from an Antarctic psychrotrophsPseudoalteromonassp.S-15-13 on the sarcoma180of mice[J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 2007,26(3):9-13.李江,陳靠山,李光友,等.南極適冷菌Pseudoalteromonassp．S-15-13胞外多糖EPS-Ⅱ?qū)π∈骃180肉瘤抑制作用的研究[J].中國海洋藥物,2007,26(3):9-13.

[31] YIN H, GE C R, CHENG Z B.The prospects of polysaccharide with biological activity in aquaculture[J].Veterinary Pharmaceutticals & FeedAdditives, 2004,9(2):16-17.殷紅,葛長榮,程志斌.生物活力多糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用前景[J].獸藥與飼料添加劑,2004,9(2):16-17.