姜麗麗，劉天慶，宋克東，關(guān)水，李香琴，葛丹

1 大連理工大學(xué)化工學(xué)院 干細(xì)胞與組織工程研發(fā)中心，遼寧 大連 116024

2 大連理工大學(xué)盤錦校區(qū) 生命與醫(yī)藥學(xué)院，遼寧 盤錦 124221

近年來，急性心肌梗死已經(jīng)成為人類死亡的主要疾病。由于心肌細(xì)胞增殖能力很弱，缺乏足夠的再生能力[1]，所以心肌發(fā)生梗死后，無法有效、完整地修復(fù)受損心肌組織，而造成心肌組織功能喪失。干細(xì)胞則為治療心肌梗死提供了新思路。其中臍帶和脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical mesenchymal stem cells，UC-MSCs and adipose derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)，由于來源廣泛、不受爭議，能夠向心肌細(xì)胞分化，表達(dá)心肌細(xì)胞的特異性蛋白，而成為治療心臟疾病、修復(fù)心肌組織的首選細(xì)胞[2-6]。然而，現(xiàn)有的 5-氮胞苷等化學(xué)誘導(dǎo)以及心肌細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)等方法，都很難使UC-MSCs或 AD-MSCs分化成具有心肌細(xì)胞功能特性 (細(xì)胞收縮和鈣瞬變現(xiàn)象等)的細(xì)胞。

有報道指出，機(jī)械力、生物活性因子、電刺激等微環(huán)境因素能夠調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs) 的分化[7]。因此有必要尋找適宜的生物活性因子，使其與心肌誘導(dǎo)劑相結(jié)合，以促進(jìn) UC-MSCs和 AD-MSCs向心肌的分化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate，S1P) 是一種具有生物活性的脂類，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化等許多生物過程[8-9]。Zhao等則報道，S1P與心肌細(xì)胞培養(yǎng)液 (Cardiomyocyte culture medium，CMCM)共同作用可以促進(jìn) UC-MSCs向心肌細(xì)胞的功能性分化[10]。于是，S1P與心肌誘導(dǎo)劑 (CMCM)共同作用能否促進(jìn)其他來源的MSCs (如 AD-MSCs)向心肌細(xì)胞的功能性分化，以及S1P適宜的作用時間和作用濃度等，都成為值得研究的內(nèi)容。

本文研究了 S1P聯(lián)合心肌細(xì)胞培養(yǎng)液協(xié)同誘導(dǎo)UC-MSCs和AD-MSCs向心肌細(xì)胞的分化。探索了 S1P的適宜作用時間和濃度，以及 S1P在CMCM分化培養(yǎng)液中對細(xì)胞活性的影響。同時通過電生理學(xué)檢測來確定 S1P是否能夠促進(jìn)兩種來源的MSCs向心肌細(xì)胞的功能性分化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

UC-MSCs的 (Cat. No. 6252，USA)和人來源的心肌細(xì)胞 (Human cardiac myocytes，HCM)(Cat. No. 6200，USA)均從 ScienCell Research Laboratories購買。AD-MSCs則由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得[11]。

UC-MSCs與 AD-MSCs培養(yǎng)：細(xì)胞(UC-MSCs and AD-MSCs) 用含 10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Sigma)、100 U/mL青霉素 (Sigma，USA)、100 μg/mL 鏈霉素 (Sigma，USA)的 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Sigma)完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到80%～90%融合時，用胰酶/EDTA (Sigma，USA)消化細(xì)胞，離心 (1 000 r/min，5 min)收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞以5 000 cells/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。第4代的細(xì)胞被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

HCM培養(yǎng)：心肌細(xì)胞以5 000 cells/cm2密度接種到培養(yǎng)瓶中，用含 10%胎牛血清 (Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Sigma)、100 U/mL青霉素(Sigma，USA)、100 μg/mL 鏈霉素 (Sigma，USA)的 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Sigma)完全培養(yǎng)基，在 37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

CMCM的提取：將心肌細(xì)胞以5 000 cells/cm2密度接種到培養(yǎng)瓶中，在含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24 h后吸出培養(yǎng)液備用，并更換新的完全培養(yǎng)基。此后，每隔24 h吸取培養(yǎng)液1次，并更換新的培養(yǎng)基。

1.2 向心肌誘導(dǎo)分化

分別在心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同含量的S1P，誘導(dǎo)UC-MSCs和AD-MSCs向心肌細(xì)胞分化。實(shí)驗(yàn)分為 5個誘導(dǎo)組：CMCM，CMCM+0.1 μmol/L S1P (Sigma)，CMCM+0.5 μmol/L S1P，CMCM+1.0 μmol/L S1P，5-azacytidine (10 μmol/L)(Sigma，USA)；2個對照組：陽性對照組 (HCM+DMEM)，陰性對照組 (UC-MSCs or AD-MSCs+DMEM)。消化收集第 4代的 UC-MSCs和AD-MSCs，以5 000 cells/cm2細(xì)胞密度接種到24孔培養(yǎng)板中，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)3 d，然后更換上面各組的分化培養(yǎng)基，繼續(xù)分化培養(yǎng)7 d、14 d和28 d。

1.3 免疫熒光染色

細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后，用PBS (Phosphate buffer solution)沖洗 3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min。PBS沖洗3次后，0.1% Triton X-100透膜30 min，然后用10%山羊血清在37 ℃下封閉1 h。含有抗 α-actin (Sigma)、connexin-43 (Sigma)和MYH-6 (Sigma)的一抗4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次后，用偶聯(lián)FITC的二抗 (Sigma)，在室溫下，避光孵育1 h。最后用DAPI (Sigma)染色細(xì)胞核，置于熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡下觀察。

使用 ImageJ軟件分析各組心肌特異性蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度，統(tǒng)計 10個不同視野下的共聚焦顯微鏡照片。分化率的統(tǒng)計方法是：統(tǒng)計實(shí)驗(yàn)組熒光照片中表達(dá) connexin-43的陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值，每組至少統(tǒng)計5個不同視野熒光顯微鏡照片。

1.4 細(xì)胞活性分析

分別在分化培養(yǎng)的第7天和14天，用MTT檢測各組細(xì)胞的活性。具體方法如下：將 MTT(Sigma) 工作液 (5 mg/mL)加入到 6孔培養(yǎng)板中 (300 μL/孔)，然后將6孔板放在37 ℃下孵育4 h。吸出MTT工作液，向6孔板中加入DMSO(Dimethyl sulfoxide，Sigma)(3 mL/孔)溶解甲瓚晶體，37 ℃孵育10 min。然后從6孔培養(yǎng)板中吸出溶解了甲瓚晶體的DMSO溶液 (200 μL/孔)，將其轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板中，用酶標(biāo)儀570 nm檢測吸光度值。

1.5 電生理學(xué)檢測

鈣瞬變是指心肌細(xì)胞收縮時發(fā)生的瞬時性鈣增高 (Calcium transients)。細(xì)胞內(nèi)的 Ca+可以用Fluo-3鈣指示劑進(jìn)行標(biāo)記，并在488 nm激發(fā)波長下，發(fā)出熒光。實(shí)驗(yàn)中檢測的熒光比值代表了細(xì)胞內(nèi)的鈣含量。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，熒光比值是一條頻率高而波幅低的相對平整的曲線，反映細(xì)胞內(nèi)的鈣處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到電場刺激而產(chǎn)生鈣瞬變時，熒光比值出現(xiàn)快速變化，反映了細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計了 3個實(shí)驗(yàn)組，包括 CMCM 組、CMCM+0.5 μmol/L S1P組及對照組5-azacytidine。

將經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞接種到9 mm直徑的玻片上，放入培養(yǎng)皿內(nèi)并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，將玻片放在顯微鏡下的灌注小室 (長 4 cm，寬1 cm，深 0.5 cm) 內(nèi)，用預(yù)熱的DMEM (37 ℃)灌注5 min。關(guān)閉進(jìn)、出液口，然后向小室中加入 5 μL Fluo-3鈣指示劑 (Invitrogen)。孵育10 min后，用預(yù)熱的DMEM (37 ℃) 連續(xù)灌注至少40 min。用40×油鏡，在488 nm (Fluo-3的激發(fā)波長)熒光下，觀察細(xì)胞中鈣的瞬變現(xiàn)象，并用 pCLAMP程序 (Axon Instrument Inc，1101 Chess Drive，F(xiàn)oster City，CA，USA)記錄鈣的瞬變。用Spike 2程序控制，對細(xì)胞進(jìn)行恒定的脈沖刺激 (脈沖頻率1 Hz)，通過DigiData 1322A A/D轉(zhuǎn)化器 (Axon Instruments Inc.)將電信號數(shù)字化 (5 kHz)，同時記錄到電腦中便于以后分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 OriginPro8.0軟件 (OriginLab Corporation，USA)分析，并且所有數(shù)據(jù)用±s表示 (SD，n=3)。采用t檢驗(yàn)，分析各組間細(xì)胞向心肌分化以及細(xì)胞活性的差異，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 S1P作用時間對細(xì)胞向心肌分化的影響

AD-MSCs和 UC-MSCs經(jīng)過 7 d、14 d和28 d的誘導(dǎo)分化后，用免疫熒光染色，檢測心肌細(xì)胞特異性蛋白 (α-actin，connexin-43，MYH-6)的表達(dá)，以確定它們是否向心肌細(xì)胞分化。CMCM+0.5 μmol/L S1P組的結(jié)果如圖1所示。經(jīng)7 d誘導(dǎo)后，AD-MSCs (圖 1A)和 UC-MSCs(圖1B)都開始表達(dá)3種心肌細(xì)胞特異性蛋白，但是表達(dá)的熒光強(qiáng)度較弱。14 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后，大部分細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白，并且熒光強(qiáng)度比7 d時明顯增強(qiáng)。而28 d誘導(dǎo)分化后，心肌細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與14 d時的相似，但是大部分細(xì)胞死亡脫落，只剩下很少數(shù)量的細(xì)胞。綜合以上結(jié)果，我們可以得出S1P的適宜作用時間是 14 d。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們都采用 14 d作為S1P的作用時間。

圖1 經(jīng)CMCM+0.5 μmol/L S1P誘導(dǎo)不同時間后AD-MSCs和UC-MSCs向心肌分化的情況Fig. 1 Cardiomyogenic differentiation of AD-MSCs and UC-MSCs in CMCM+0.5 μmol/L S1P after being incubated at different time. The expression of three cardiac specific proteins was used to evaluate the cardiomyogenic differentiation of AD-MSCs (A) and UC-MSCs (B) in CMCM+0.5 μmol/L S1P.

另外，本文還檢測了常用誘導(dǎo)劑(5-azacytidine)誘導(dǎo)后AD-MSCs和UC-MSCs在不同時間點(diǎn)向心肌分化的情況。結(jié)果顯示，經(jīng)5-azacytidine處理24 h后，AD-MSCs (圖2A)和UC-MSCs (圖2B)在誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天時開始表達(dá)心肌特異性蛋白 (α-actin, connexin-43，MYH-6)，誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d時這些心肌特異性蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。但與圖1中CMCM+ 0.5 μmol/L S1P組的分化時間相比，5-azacytidine組心肌分化時間明顯延后。

為了消除一抗與二抗等因素對染色結(jié)果的干擾，本文設(shè)置了陽性對照組和陰性對照組。用DMEM培養(yǎng)的UC-MSCs和AD-MSCs作為陰性對照組，而DMEM培養(yǎng)的HCM作為陽性對照組。結(jié)果表明，陰性對照組的 UC-MSCs和AD-MSCs都不表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白，而陽性對照的HCM表達(dá)3種心肌特異性蛋白 (圖3)。

2.2 S1P濃度對細(xì)胞向心肌分化的影響

隨著 S1P在 CMCM中濃度的增加，UC-MSCs表達(dá) α-actin和 connexin-43增加，而MYH-6的表達(dá)則隨著S1P濃度增加而出現(xiàn)了極值 (CMCM+0.5 μmol/L S1P 組)(圖 4B)。并且，與不加S1P的組相比，這些蛋白的表達(dá)均顯著增強(qiáng) (P＜0.05)(圖5B)。另外，從圖中還可以觀察到，5-azacytidine組表達(dá)的心肌特異性蛋白的熒光強(qiáng)度要明顯低于CMCM組 (圖4B)，并且具有顯著性差異 (P＜0.05)(圖5B)。

圖2 經(jīng)5-azacytidine誘導(dǎo)不同時間后AD-MSCs和UC-MSCs向心肌分化的情況Fig. 2 Cardiomyogenic differentiation of AD-MSCs and UC-MSCs in 5-azacytidine after being induced at different time. The expression of three cardiac specific proteins was used to evaluate the cardiomyogenic differentiation of AD-MSCs (A)and UC-MSCs (B)in 5-azacytidine.

圖3 對照組中細(xì)胞的心肌特異性蛋白表達(dá)Fig. 3 Expression of cardiac specific protein of cells in control groups. UC-MSCs or AD-MSCs were cultured in normal medium (DMEM)as negative control, HCM was cultured in normal medium (DMEM)as positive control.

對于AD-MSCs，3種心肌特異性蛋白的表達(dá)都隨著S1P濃度的增加而增強(qiáng) (圖4A)，并且與不添加 S1P相比都具有顯著性差異 (P＜0.05)(圖5A)。而5-azacytidine組表達(dá)的心肌特異性蛋白的熒光強(qiáng)度雖然低于CMCM組 (圖4A)，但是并沒有顯著性差異 (圖 5A)?？傊?，常用誘導(dǎo)劑5氮胞苷使兩種MSCs向心肌分化的效果都不如CMCM，更不如CMCM + S1P的分化效果。

另外，本文還通過分析 connexin-43陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，來確定各種分化條件下UC-MSCs與AD-MSCs的分化率，包括CMCM組、CMCM+0.5 μmol/L S1P組以及5-azacytidine組，結(jié)果如圖6所示?？梢娊?jīng)3種分化培養(yǎng)基處理后，AD-MSCs與UC-MSCs向心肌的分化率比較相近，都在30%～35%范圍內(nèi)，沒有顯著性差異。提示 S1P在 CMCM中不能顯著提高AD-MSCs與UC-MSCs向心肌的分化率。

2.3 S1P濃度對細(xì)胞活性的影響

圖4 經(jīng)不同分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)后UC-MSCs與AD-MSCs向心肌分化的情況Fig. 4 Cardiomyogenic differentiation of AD-MSCs and UC-MSCs incubated in different culture medium. The differentiation of AD-MSCs (A)and UC-MSCs (B)toward cardiomyocytes was examined by immunofluorescence.

圖5 不同培養(yǎng)條件下AD-MSCs與UC-MSCs向心肌分化特異性蛋白表達(dá)強(qiáng)度的比較Fig. 5 Comparison the cardiomyogenic differentiation of AD-MSCs and UC-MSCs incubated in different medium.The fluorescence intensity of the images for AD-MSCs (A)and UC-MSCs (B)was analyzed using software of Image J.The data were expressed as ±s (SD, n=3). * indicates statistically significant (P<0.05)difference of fluorescence intensity compared with CMCM group.

圖6 不同分化培養(yǎng)條件下AD-MSCs與UC-MSCs的心肌分化率對比Fig. 6 Comparison of cardiomyogenic differentiation percentage of AD-MSCs and UC-MSCs incubated in different medium. The percentage of AD-MSCs (A) and UC-MSCs (B) expressing connexin-43 was used to evaluate cardiomyogenic differentiation after CMCM, CMCM+0.5 μmol/L S1P and 5-azacytidine incubation. The data were expressed as ±s deviation (SD, n=3). Statistically significant difference (P<0.05) compared with CMCM group.

細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，S1P對 UC-MSCs和AD-MSCs是有毒性的，并且隨著S1P濃度的增加，UC-MSCs和AD-MSCs的細(xì)胞活性明顯降低，與不加S1P組 (CMCM)相比具有顯著性差異 (P＜0.05)(圖 7)。同時也可以發(fā)現(xiàn)，5-azacytidine組和 DMEM 組細(xì)胞活性明顯高于CMCM 培養(yǎng)基組，并且 5-azacytidine 組和DMEM組細(xì)胞14 d時的細(xì)胞活性值 (圖7B)要高于7 d時的細(xì)胞活性值 (圖7A)，而CMCM各組的結(jié)果則正好相反。

圖7 細(xì)胞在不同分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d和14 d后的細(xì)胞活性對比Fig. 7 Comparison of cell activity of UC-MSCs and AD-MSCs cultured in different medium on the 7th day and 14th day. Cell activity of UC-MSCs or AD-MSCs on the 7th day (A)and 14th day (B)was evaluated by MTT. The data were expressed as ±s deviation (SD, n=3). * indicates statistically significant (P<0.05)difference of cell activity compared with CMCM group.

2.4 S1P對細(xì)胞鈣瞬變的影響

電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，AD-MSCs與UC-MSCs在CMCM及5-azacytidine分化培養(yǎng)液中分化培養(yǎng)14 d以后，再經(jīng)電場刺激，這些細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度始終保持相對穩(wěn)定，沒有發(fā)生任何鈣濃度激增，即沒有發(fā)生鈣瞬變。而在CMCM+0.5 μmol/L S1P中分化培養(yǎng)14 d、再經(jīng)電刺激后，AD-MSCs與 UC-MSCs內(nèi)鈣離子濃度均發(fā)生了瞬時性增高，即發(fā)生了鈣瞬變。這說明S1P能夠促進(jìn)UC-MSCs與AD-MSCs在CMCM中向心肌的功能性分化，使分化細(xì)胞具有心肌細(xì)胞的功能性 (鈣瞬變)。

3 討論

MSCs由于其來源廣泛、來源沒有倫理道德問題，且具有自我更新、多向分化、免疫原性低等生物學(xué)特性，而成為干細(xì)胞移植治療心肌梗死的主要細(xì)胞來源。臍帶和脂肪組織較易獲得，且對供體造成的痛苦小，成為MSCs的熱點(diǎn)來源。許多研究表明UC-MSCs和AD-MSCs在心肌誘導(dǎo)劑 (CMCM或是5-氮胞苷)作用下，能夠分化成心肌細(xì)胞，分化時間從2周到5周[4-6,12]。本研究結(jié)果表明，在 5-氮胞苷作用下，UC-MSCs與AD-MSCs從14 d時開始向心肌細(xì)胞分化，28 d時分化加強(qiáng)，表現(xiàn)為心肌特異性蛋白表達(dá)加強(qiáng)。而在 S1P與心肌誘導(dǎo)劑 (CMCM)的共同作用下，UC-MSCs和AD-MSCs最早在第7天就開始表達(dá)心肌特異性蛋白。這些結(jié)果提示，S1P與CMCM共同作用可以適當(dāng)提前 MSCs向心肌分化的時間。但是，7 d時心肌特異性蛋白表達(dá)強(qiáng)度很弱，明顯低于經(jīng)14 d或是28 d誘導(dǎo)的細(xì)胞。而經(jīng)28 d誘導(dǎo)后，心肌特異性蛋白的表達(dá)雖然很強(qiáng)，但S1P降低了細(xì)胞活性，使細(xì)胞大量死亡脫落，僅剩下少量細(xì)胞。所以，本研究確定S1P在CMCM中的適宜作用時間為14 d。

圖8 分化細(xì)胞的電生理學(xué)特性的分析Fig. 8 Electrophysiological characters analysis. Calcium transient of UC-MSCs or AD-MSCs in CMCM, CMCM+0.5 μmol/L S1P, and 5-azacytidine groups were observed. Fluorescence signals were normalized in terms of the fractional fluorescence change (F/F0). And F/F0 indicated the amplitude of the calcium transients; F0 was the baseline fluorescence, indicating the normal intracellular Ca+ fluorescence intensity without calcium transients; F was the fluorescence intensity at any given time. X axis indicated the scanning time.

很多研究指出 S1P能夠調(diào)控許多心血管過程 (Cardiovascular processes)，包括血管生成、心肌功能、血管發(fā)育以及心臟發(fā)育等[13-15]。另外一些研究還證實(shí)，S1P與肌分化的調(diào)控有關(guān)[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)S1P與心肌誘導(dǎo)劑 (心肌細(xì)胞培養(yǎng)液)共同作用，能夠促進(jìn) UC-MSCs和AD-MSCs向心肌細(xì)胞的功能性分化。并且這種促進(jìn)作用是濃度依賴的，這一結(jié)果與此前報道的S1P濃度依賴性的促進(jìn)AD-MSCs向平滑肌細(xì)胞分化相一致[7]。但由于細(xì)胞活性隨S1P濃度增加而不斷下降，因此本文選擇 0.5 μmol/L作為S1P在CMCM中的適宜作用濃度。另外，本文的研究結(jié)果還顯示，雖然添加S1P可以很明顯的促進(jìn)UC-MSCs和AD-MSCs向心肌分化的程度(表現(xiàn)為心肌特異性蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng))，但是并沒有顯著提高兩種MSCs向心肌分化的細(xì)胞數(shù)目或分化率。這一結(jié)果與此前的一篇報道相類似，Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間增加，CMCM組與CMCM+S1P組表達(dá)肌動蛋白、肌球蛋白的細(xì)胞百分含量顯著提高，但是同一時間點(diǎn)上，兩組表達(dá)肌動蛋白、肌球蛋白的細(xì)胞百分含量則相似，沒有顯著變化。

收縮是心肌細(xì)胞的重要功能，其觸發(fā)源于細(xì)胞內(nèi)的鈣瞬變。鈣瞬變是Ca+介導(dǎo)的興奮-收縮偶聯(lián)，是心肌收縮的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]，其具體過程為：當(dāng)心肌細(xì)胞受到外界電場刺激時，引起其胞膜上的電壓依賴性L-型鈣通道開放，胞外Ca+內(nèi)流，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高，通過鈣誘導(dǎo)鈣釋放的方式引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣庫，即肌質(zhì)網(wǎng)在短時間內(nèi)向胞質(zhì)釋放大量的鈣，造成胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的瞬時升高。本研究結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)過CMCM+S1P處理后，當(dāng)加入電場刺激時，向心肌分化了的細(xì)胞發(fā)生了鈣瞬變，而未添加 S1P組與5-azacytidine組的細(xì)胞則沒有鈣瞬變。這說明常規(guī)的誘導(dǎo)方法 (CMCM和5-azacytidine誘導(dǎo))不能夠使UC-MSCs和AD-MSCs向心肌的功能性分化，而 S1P可以與 CMCM 共同作用，促進(jìn)UC-MSCs和AD-MSCs向心肌的功能性分化，使它們具有類似心肌細(xì)胞的鈣瞬變。

研究發(fā)現(xiàn)，S1P是通過作用于細(xì)胞膜上G-蛋白偶聯(lián)受體家族來發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)的[9,19-20]。Wamhoff等[21]的研究證明，S1P通過作用于細(xì)胞上的S1P1和S1P3受體，來調(diào)控細(xì)胞的增殖，而S1P2受體則在調(diào)控收縮蛋白表型中起到關(guān)鍵作用。另一篇報道[22]則指出，S1P2和 S1P3參與了S1P促進(jìn)中胚層前體細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的進(jìn)程。Nincheri等[23]的研究顯示，AD-MSCs中存在 5種 S1P受體，他們應(yīng)用受體抑制劑，證明S1P2在S1P促進(jìn)AD-MSCs向平滑肌細(xì)胞分化中起到重要作用，而S1P1起到次要作用。事實(shí)上，當(dāng)抑制 S1P2時，肌分化相關(guān)的標(biāo)志基因表達(dá)以及L-型鈣離子電流的誘導(dǎo)都被取消。而當(dāng)選擇性抑制S1P1時，由S1P引起的多種生物學(xué)效應(yīng)僅僅是被削弱。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，動脈損傷后平滑肌特異性蛋白 α-actin的表達(dá)需要激活S1P2，這又一次證明在平滑肌分化中 S1P2的重要作用[24]。由此可以推測，S1P可能是通過作用于UC-MSCs和AD-MSCs細(xì)胞膜上的S1P2受體，來調(diào)控細(xì)胞表達(dá)心肌特異性蛋白的，從而使細(xì)胞具有心肌細(xì)胞特異性表型以及特異性功能 (鈣瞬變)。

4 結(jié)論

S1P能夠與心肌細(xì)胞培養(yǎng)液一起協(xié)同作用，促進(jìn)UC-MSCs和AD-MSCs向心肌的功能性分化。并且，隨著S1P濃度的增加，促分化作用增強(qiáng)，但細(xì)胞活性降低。S1P在 CMCM 中促進(jìn)UC-MSCs和 AD-MSCs向心肌分化存在著適宜的作用時間和濃度，分別是14 d和0.5 μmol/L。

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