田康明，周麗，陳獻(xiàn)忠，沈微，石貴陽(yáng)，Suren Singh，路福平，王正祥

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

2 發(fā)酵糧食國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122

3 德班理工大學(xué) 生物工程與食品技術(shù)學(xué)院應(yīng)用科學(xué)系，南非 德班 4001

4 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

油脂水解工業(yè)中的主要副產(chǎn)物甘油正成為發(fā)酵工業(yè)中重要的碳源之一[1]。生物柴油工業(yè)的健康發(fā)展從某種意義上講，決定于副產(chǎn)物甘油的就地快捷轉(zhuǎn)化工業(yè)的成功實(shí)施[2]。由于甘油分子較葡萄糖具有更高的還原力，因此，以甘油為碳源的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程一定有其特點(diǎn)[3-9]。作者所在的課題組，前期建立了好氧菌體生長(zhǎng)和微好氧發(fā)酵產(chǎn)酸兩階段甘油發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝，并通過(guò)構(gòu)建同型乳酸發(fā)酵的重組大腸桿菌顯著地提高了 D-乳酸的合成速率[10]。不足的是，氧氣的存在使得甘油較多地流向了細(xì)胞合成，因此，盡管通過(guò)增加乳酸脫氫酶的基因拷貝數(shù)增強(qiáng)了乳酸的合成效率，最優(yōu)發(fā)酵條件下的乳酸得率達(dá)到了78%，但提升的空間仍然巨大[10]。

為進(jìn)一步提高甘油到D-乳酸的轉(zhuǎn)化率，本研究首先探索不同培養(yǎng)溫度下重組菌好氧與厭氧代謝甘油的特征，在此基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化了一種新型D-乳酸變溫發(fā)酵工藝，并進(jìn)一步引入了溫度誘導(dǎo)型D-乳酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，甘油到乳酸的得率得到顯著提高。

1 材料與方法

1.1 菌株

重組菌 Escherichia coli CICIM B0013-070(B0013, Dack-pta Dpps DpflB Ddld DpoxB DadhEDfrdA)和 E. coli CICIM B0013–070B (B0013-070,ldhAp::kan-cIts857-pR–pL)，由江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源和信息中心 (CICIM-CU，http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基[10]，添加瓊脂2%即為固體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：M9培養(yǎng)基添加0.1%的MgSO4母液 (1 mol/L)和 0.1%的微量元素母液。甘油添加量根據(jù)不同發(fā)酵方式進(jìn)行確定。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.3.1 最適生長(zhǎng)溫度和最適產(chǎn)酸溫度的確定

在30 ～45 ℃℃條件下確認(rèn)最適的菌體生長(zhǎng)溫度；在37 ～50 ℃℃和150 r/min條件下，搖床培養(yǎng)，確認(rèn)最適的發(fā)酵產(chǎn)酸溫度。

1.3.2 溫度誘導(dǎo)型D-乳酸脫氫酶表達(dá)系統(tǒng)的引入

按照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜的菌體生長(zhǎng)溫度有助于獲得高活性的細(xì)胞

發(fā)酵工業(yè)體系中最高生物量以及最高細(xì)胞代謝活力與產(chǎn)物形成最大化之間，往往不能統(tǒng)一，有時(shí)甚至互為矛盾。在有機(jī)酸發(fā)酵過(guò)程中，這一矛盾尤為顯著[12]。為此，首先探討了培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累間影響特征，結(jié)果如圖 1A所示。在34 ～37 ℃℃下表現(xiàn)出最優(yōu)的生長(zhǎng)性能。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在34 ℃下，好氧菌體生長(zhǎng)階段后期乳酸的積累量明顯低于37 ℃ (圖1B)。因此，選擇34 ℃培養(yǎng)溫度為菌體生長(zhǎng)的最適溫度。

2.2 發(fā)酵階段適度提升發(fā)酵溫度更有利于D-乳酸合成

在獲得了較高活性的菌體后，發(fā)酵溫度達(dá)到42 ℃時(shí)，菌體總量較發(fā)酵初始時(shí)沒有明顯增加，乳酸積累量則達(dá)到最大值。在此溫度下，甘油到乳酸的得率最高 (圖2)。

2.3 變溫工藝下重組菌合成 D-乳酸的效率得到顯著提升

在7 L發(fā)酵罐中，細(xì)胞生長(zhǎng)階段使用34 ℃培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物形成階段使用42 ℃培養(yǎng)。好氧階段由原來(lái)的9.7 h縮短為9.4 h。產(chǎn)物形成階段，升高的培養(yǎng)溫度，提高了乳酸脫氫酶的催化活性并限制了菌體的生長(zhǎng)，甘油到乳酸的得率提高到 82.6%(圖 3A)。

2.4 溫度誘導(dǎo) D-乳酸脫氫酶表達(dá)提高了甘油到D-乳酸的轉(zhuǎn)化效率

將ldhA的啟動(dòng)子替換為溫度誘導(dǎo)型l噬菌體的pR-pL串聯(lián)啟動(dòng)子，獲得了重組菌070B[11]。在7 L發(fā)酵罐中，好氧階段的生長(zhǎng)周期進(jìn)一步縮短為8.7 h。變溫發(fā)酵工藝下，經(jīng)過(guò)30 h的好氧菌體生長(zhǎng)和微好氧發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程，發(fā)酵液中的乳酸終濃度達(dá)到127.0 g/L，產(chǎn)酸速率也由3.66 g/(L·h)提高到 4.23 g/(L·h)。甘油到乳酸的得率進(jìn)一步提高到88.9% (圖 3)。

大腸桿菌利用甘油合成乳酸的研究，始于2009年清華大學(xué)首次報(bào)道的一株野生大腸桿菌代謝甘油合成乳酸的研究[13]，盡管野生菌株合成乳酸過(guò)程中伴生了乙酸、琥珀酸、甲酸和酒精等副產(chǎn)物[10,13-14]。隨后的研究中，通過(guò)代謝途徑修飾實(shí)現(xiàn)了甘油到乳酸的同型發(fā)酵生產(chǎn)[2,10]，但全程限氧發(fā)酵工藝中，甘油到乳酸的轉(zhuǎn)化速率不高[2,13]。因此，作者所在的課題組提出了充分好氧獲得足夠的菌體活性，然后在轉(zhuǎn)入微好氧發(fā)酵產(chǎn)酸的發(fā)酵方式[10]。

圖1 不同溫度下E. coli CICIM B0013-070的生長(zhǎng)特征和D-乳酸合成Fig. 1 Growth and D-lactate yield of CICIM B0013-070 at different temperatures. (A)Cell growth. (B)D-lactate yield.

圖2 發(fā)酵產(chǎn)酸階段不同發(fā)酵溫度下E. coli CICIM B0013-070菌體量的積累和乳酸生成Fig. 2 Biomass accumulation and D-lactate production of E. coli CICIM B0013-070 during the fermentation phase under different temperature. (A)Cell growth. (B)D-Lactate accumulation.

圖3 變溫工藝下重組菌在7 L發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸情況Fig. 3 Cell growth and D-lactate production using temperature-switched fermentation process. The arrow indicates the time when the culture was switched from the aerobic cultivation at 34 °C to the microaerobic production phase at 42 °C. (A)E. coli CICIM B0013-070. (B)E. coli CICIM B0013-070B; ■: D-lactate; ●: acetate; ▲: succinate; □: pyruvate; △: cell mass.

溫度提高對(duì)菌體生長(zhǎng)的限制存在多種解釋。目前被認(rèn)可的一種解釋是，溫度提高后，用于賴氨酸合成的關(guān)鍵酶的活性降低，導(dǎo)致甲硫氨酸合成受阻，最終導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到限制[15]?？梢源_認(rèn)的是，發(fā)酵溫度升高到42 ℃后，菌體的生長(zhǎng)受到了一定的限制，而乳酸的合成過(guò)程在發(fā)酵階段前期有所增強(qiáng)，因此最終提高了甘油到乳酸的轉(zhuǎn)化效率。引入D-乳酸脫氫酶溫度誘導(dǎo)表達(dá)后，使得在整個(gè)發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程中D-乳酸脫氫酶的酶活水平持續(xù)維持在較高的水平，從而實(shí)現(xiàn)了甘油到乳酸的高效合成?？梢钥闯觯儨匕l(fā)酵工藝的建立和溫度誘導(dǎo)型乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的引入有效地提高了甘油到乳酸的合成速率和得率。這一過(guò)程的實(shí)現(xiàn)對(duì)于解決其他重大發(fā)酵產(chǎn)物合成過(guò)程與菌體生長(zhǎng)之間的矛盾關(guān)系同樣有借鑒意義。

[1]Durnin G, Clomburg J, Yeates Z, et al. Understanding and harnessing the microaerobic metabolism of glycerol in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng, 2009, 103: 148?161.

[2]Mazumdar S, Clomburg JM, Gonzalez R. Engineered Escherichia coli strains for the homofermentative production of D-lactic acid from glycerol. Appl Environ Microbiol,2010, 76: 4327?4336.

[3]Blankschien MD, Clomburg JM, Gonzalez R. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of succinate from glycerol. Metab Eng, 2010, 12: 409?419.

[4]Ito T, Nakashimada Y, Senba K, et al. Hydrogen and ethanol production from glycerol-containing wastes discharged after biodiesel manufacturing process. J Biosci Bioeng, 2005, 100:260?265.

[5]Pagliaro M, Ciriminna R, Kimura H, et al. From glycerol to value-added products. Angew Chem Int Ed Engl, 2007, 46:4434?4440.

[6]Shams Yazdani S, Gonzalez R. Engineering Escherichia coli for the efficient conversion of glycerol to ethanol and co-products. Metab Eng, 2008, 10: 340?351.

[7]Yazdani SS, Gonzalez R. Anaerobic fermentation of glycerol: a path to economic viability for the biofuels industry. Curr Opin Biotechnol, 2007, 18: 213?219.

[8]Zhang X, Shanmugam KT, Ingram LO. Fermentation of glycerol to succinate by metabolically engineered strains of Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 2010, 76:2397?2401.

[9]Liu H, Kang J, Qi Q, et al. Production of lactate in Escherichia coli by redox regulation genetically and physiologically. Appl Biochem Biotechnol, 2011, 164: 162?169.

[10]Tian KM, Chen XZ, Shen W, et al. High-efficiency conversion of glycerol to D-lactic acid with metabolically engineered Escherichia coli. Afri J Biotechnol, 2012, 11:4860?4867.

[11]Zhou L, Niu DD, Tian KM, et al. Genetically switched D-lactate production in Escherichia coli. Metab Eng, 2012,14: 560?568.

[12]Zhou L, Tian KM, Niu DD, et al. Improvement of D-lactate productivity in recombinant Escherichia coli by coupling production with growth. Biotechnol Lett, 2012, 34:1123?1130.

[13]Hong AA, Cheng KK, Peng F, et al. Strain isolation and optimization of process parameters for bioconversion of glycerol to lactic acid. J Chem Technol Biotechnol, 2009, 84:1576?1581.

[14]Zhu Y, Eiteman MA, DeWitt K, et al. Homolactate fermentation by metabolically engineered Escherichia coli strains. Appl Environ Microbiol, 2007, 73: 456?464.

[15]Ron EZ, Davis BD. Growth rate of Escherichia coli at elevated temperatures: limitation by methionine. J Bacterial,1971, 107: 391?396.