韓爽，夏天，李慶寧，郭俊明，陸佩蓓

1 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211

2 寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315010

惡性腫瘤是造成人類死亡的主要原因之一，早期診斷是更好地治療腫瘤和降低其死亡率的最有效辦法。傳統(tǒng)的腫瘤診斷方法 (如CT、MRI和PET等)不能檢測到體積小于2 cm的腫瘤；傳統(tǒng)的治療方法 (如放療、化療和介入治療等)價格昂貴，不良反應(yīng)較多，治療效果不理想。因此，需要建立新的診斷和篩查技術(shù)以及有效的治療方法，以降低腫瘤的死亡率。

納米材料因其獨特性質(zhì)在光學(xué)、磁學(xué)、化妝品、催化、制藥和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用日益增多。納米技術(shù) (Nanotechnology) 是21世紀(jì)的新興技術(shù)。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料為包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的診治提供了嶄新的解決途徑和借鑒價值[1]。量子點 (Quantum dots，QDs)是一種直徑在10 nm以內(nèi)的半導(dǎo)體納米材料，比普通細(xì)胞的體積小數(shù)千倍，且具有吸收波長范圍寬和發(fā)射波長范圍窄的特性。量子點的材料有很多種，如硒化鎘 (CdSe)、硫化鋅 (ZnS)、砷化銦(InAs) 和碲化鎘 (CdTe)等。不同材料及不同大小的量子點會發(fā)出不同的熒光[2]，例如：不同的CdTe量子點能分別在535 nm (綠色光，G-QDs)、598 nm (黃色光，Y-QDs)和654 nm (紅色光，R-QDs)處具有最大光發(fā)射量[3]。本實驗室在不同酸堿條件下制備得到的 CdTe量子點，可在紫外光激發(fā)下發(fā)射出不同波長的熒光 (圖1)。

圖1 不同pH值下制備的量子點在365 nm的紫外光激發(fā)下發(fā)射出不同熒光Fig. 1 Different fluorescence of QDs under 365 nm UV irradiation, which prepared under different pH conditions. (A)ddH2O. (B)pH 9.5. (C)pH 10.2. (D)pH 11.4.

量子點是納米范圍的微型發(fā)光粒子，與有機染料和熒光蛋白相比，它們具有獨特的光學(xué)和電學(xué)特性、大小可調(diào)的光發(fā)射性能、卓越的信號強度，也有抗淬滅、廣泛的吸收光譜、同時激發(fā)多種熒光顏色等性質(zhì)。因此，量子點可彌補有機熒光染料的不足，具有代替熒光染料的潛能，可成為一種新型的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)熒光標(biāo)記。作為一種熒光標(biāo)簽，半導(dǎo)體量子點可被廣泛應(yīng)用于免疫復(fù)合物及RNA雜交過程分析、細(xì)胞分類與示蹤、靶向、治療載體、藥物傳遞、納米醫(yī)學(xué)、體內(nèi)成像與體外生物標(biāo)記等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4-12]。此外，對量子點修飾，能為腫瘤成像和治療提供一個可設(shè)計的多功能納米支架[13]?？傊?，在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究及臨床影像應(yīng)用中功能化的量子點極具潛在價值，將為腫瘤診治提供新途徑。

1 功能化量子點用于腫瘤早期診斷和治療

目前，用于腫瘤早期診斷的生化方法多基于酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，這類方法操作繁雜、費用不菲，而且重復(fù)性不佳，往往需要檢測多種生物標(biāo)志物才能達到較為理想的診斷效率。為實現(xiàn)早期診斷腫瘤的目的，定期和動態(tài)觀察標(biāo)志物水平變化是一種有效的辦法，但這種檢查周期過長，不易堅持，對偏僻地區(qū)患者有一定操作難度；并且當(dāng)腫瘤標(biāo)志物濃度僅發(fā)生輕微改變時，現(xiàn)有的大部分篩選方法在診斷決定值 (在臨床類別中的最佳分界點，區(qū)別精確評估患者腫瘤疾病早期階段的分界點)附近檢測受限[14]。近年來，納米顆粒，尤其是具有水溶性和易結(jié)合功能團等優(yōu)勢的量子點在作為診斷和藥物傳送工具上的應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注，并為腫瘤診治提供了很多潛在途徑。

目前，量子點應(yīng)用于腫瘤診斷和治療的思路存在交叉和共通之處，主要可通過2種方式來進行：一是利用其特殊的光學(xué)性質(zhì)，進行成像檢測、通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET)和光動力對腫瘤進行治療；二是將量子點功能化，在其表面添加一些生物活性物質(zhì)用于檢測腫瘤標(biāo)志物，或在其內(nèi)部嵌入基因片段、肽鏈和一些化療藥物，進行腫瘤靶向治療。量子點在生物系統(tǒng)內(nèi)的潛在毒性與清除也非常值得關(guān)注[4]。很多研究表明，經(jīng)明膠、聚乙二醇等材料包被后的功能化量子點可大幅改善其生物相容性[15]。本文著重從分子靶向識別、淋巴結(jié)定位方面來探討量子點用于腫瘤早期診斷的新進展；從藥物傳遞方面探討量子點應(yīng)用于腫瘤的治療；并討論了量子點的毒性和局限性以及用于腫瘤檢測和治療的多功能量子點的設(shè)計。

1.1 用于分子靶向識別

現(xiàn)階段，無論是腫瘤診斷還是治療，對腫瘤靶向識別是關(guān)鍵。腫瘤組織表面很多特異性蛋白質(zhì)以及腫瘤組織特異性表達的基因都可作為靶標(biāo)用于腫瘤的檢測。這些腫瘤標(biāo)志物在腫瘤早期診斷和治療中表現(xiàn)出巨大潛力，可以用于腫瘤篩選、分期、轉(zhuǎn)移評價、確定藥物干預(yù)反應(yīng)[14,16-18]。利用量子點結(jié)合腫瘤標(biāo)志物檢測癌癥已有較多報道 (表 1)。

研究人員利用量子點合成了電化學(xué)量子點(Electrochemical QDs, EC QDs)，作為一種電化學(xué)編碼的量子點條碼，成功檢測了腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原 (Carcinoembryonic antigen, CEA)，在腫瘤標(biāo)志物的檢測中具有潛在意義[37]。Diagaradjane等[24]對量子點與表皮生長因子 (Epidermal growth factor, EGF)進行生物結(jié)合，成功得到納米探針，根據(jù) EGF受體的表達量成像，在小鼠體內(nèi)檢測結(jié)腸癌。另外有研究表明，葉酸包被的量子點也成功在體外檢測到人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2[15]。對于嚴(yán)重威脅女性生命的卵巢癌、宮頸癌和乳腺癌，很多科研人員也做了體外實驗。Jokerst等[14]利用量子點制作納米芯片檢測乳腺癌、睪丸癌、結(jié)腸癌和卵巢癌患者血清和唾液中的腫瘤標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)能檢測到低至 0.01 pmol/L的腫瘤標(biāo)志物，比ELISA的檢測范圍擴大2倍，用時卻更短。多名實驗者用Her-2結(jié)合的量子點進行NIR分子成像，在體外成功檢測到人乳腺癌細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)合成的量子點探針的毒性很小，意味著將來在體內(nèi)成像中存在巨大潛力[19-20]。在一項卵巢癌的研究中，研究者用巰基乙酸(Mercaptoacetic acid, MAA)包被的量子點在體外成功檢測到人卵巢癌細(xì)胞[38]。Sun等[30]利用CEACAM8抗體結(jié)合的量子點對宮頸癌HeLa細(xì)胞進行免疫熒光成像，取得良好效果。實驗證明，通過用分子標(biāo)記-QDs定量單個活細(xì)胞產(chǎn)生的總熒光信號，測量乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中內(nèi)源性原癌基因c-myc的表達，可精確地檢測到RNA的含量，從而進行診斷[16]。在胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中也有相關(guān)研究 (表1)。還有很多研究員致力于對腫瘤血管成像的研究，他們在量子點表面結(jié)合RGD肽鏈和integrin αvβ3，成功制備了雙功能量子點探針，這種探針對腫瘤血管進行PET/NIRF成像，極大地減少了深部組織定量靶向成像中的潛在毒性，并克服了光學(xué)成像中的組織穿透力限制，與單獨使用NIRF相比，可以檢測到更低濃度的腫瘤造影劑[28]。量子點可同時用于癌癥成像和病理檢測，將兩者結(jié)合后對乳腺癌進行診斷，通過雙色成像可實現(xiàn)對乳腺癌侵襲的早期檢測[22]。量子點特殊的熒光性質(zhì)使得成像效果更好。

此外，腫瘤的異質(zhì)性是惡性腫瘤的特征之一，是指腫瘤在生長過程中，經(jīng)過多次分裂增殖，其子細(xì)胞呈現(xiàn)出分子生物學(xué)或基因方面的改變，從而使腫瘤的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性、預(yù)后等各方面產(chǎn)生差異。腫瘤異質(zhì)性在腫瘤研究和治療中都是關(guān)鍵問題。研究人員利用E-Cadherin、高分子量角蛋白、p63、α-methylaiyl CoA消旋酶結(jié)合的量子點顯示了結(jié)構(gòu)迥異的前列腺體，并在分子、細(xì)胞和結(jié)構(gòu)水平揭示了人前列腺體由2層基底和管腔細(xì)胞變?yōu)閱螌訍盒约?xì)胞的結(jié)構(gòu)改變過程[39]。參與癌癥增殖、存活和轉(zhuǎn)移的跨膜酪氨酸激酶-I型胰島素樣生長因子受體也可以用于診斷腫瘤，實驗表明利用結(jié)合AVE-1642的量子點可檢測出這種受體，用于腫瘤診斷[40]。以上研究都表明，量子點在腫瘤診斷中極具潛力，將量子點靶向與PET、NIR等現(xiàn)有成像方法相結(jié)合，能方便快速地對腫瘤進行早期診斷。對于臨床診斷應(yīng)用，量子點所提供的相關(guān)分子和形態(tài)信息是傳統(tǒng)的組織染色和分子分析方法所不能達到的。

表1 與量子點結(jié)合的主要腫瘤標(biāo)志物Table1 Tumor markers binding to QDs

1.2 用于淋巴結(jié)的定位

在一些對前哨淋巴結(jié)定位的研究中，量子點也表現(xiàn)出極大潛力。前哨淋巴結(jié) (Sentinel lymph node, SLN)是原發(fā)性腫瘤引流區(qū)域淋巴結(jié)中的特殊淋巴結(jié)，是原發(fā)性腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所必經(jīng)的第一批淋巴結(jié)。SLN可作為確定腫瘤部位、決斷手術(shù)切除范圍和分析腫瘤細(xì)胞存在的位點，也是阻止腫瘤細(xì)胞從淋巴道擴散的屏障，其臨床意義已受到人們的重視。

目前僅有3種方法用于探測 SLN：1) 藍色染色法。使用美蘭等染料，其效果不好；2) 核素探測法。因涉及到放射性元素，對人體有一定的輻射作用，同時會對環(huán)境造成污染，使用較麻煩，設(shè)備也很昂貴，沒有在臨床中推廣；3) 熒光探測法。此為最新的一種快速、安全的檢測方法，使用光動力眼 (Photodynamic eye, PDE)觀看 ICG示蹤劑，也可快速找到 SLN，并且成像在顯示器上。因此，設(shè)計出可在淋巴管道內(nèi)穿梭并在第一個遇到的淋巴結(jié)處停止的量子點，根據(jù)量子點的光學(xué)特性，可用 NIR熒光成像檢測到SLN[41-43]。除了定位前哨淋巴結(jié)外，Robe等[44]還用量子點成功定位了腋下淋巴結(jié) (Axillary lymph node, ALN)，為實時檢測提供了依據(jù)。對淋巴結(jié)的準(zhǔn)確定位為腫瘤切除提供了指導(dǎo)。

1.3 用于藥物傳遞系統(tǒng)

量子點大的表面可結(jié)合細(xì)胞靶向分子，對藥物進行傳遞和跟蹤。利用量子點的特性制成的細(xì)胞-靶向熒光納米生物標(biāo)簽是非常有用的工具，可用來識別靶向細(xì)胞，傳遞追蹤的藥物和其他藥物[31]。具有 Proton-Sponge效應(yīng)的量子點可將siRNA轉(zhuǎn)運入MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞[17]。有研究人員用量子點對腫瘤細(xì)胞中的 siRNA表達進行體內(nèi)成像，并將其運輸至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，抑制腫瘤生長[18]。傳統(tǒng)的藥物治療使很多患者具有了多藥耐藥性，研究者用量子點碲化鎘進行藥物傳遞并作用于肝癌細(xì)胞HepG2和ADM，證實量子點載體減少了細(xì)胞的多藥耐藥性[45]。由于量子點通常是不能滲透細(xì)胞的，所以需要轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助才能穿越細(xì)胞膜。Zhang等[46]提出了一個簡單而靈活的方法，即利用基質(zhì)金屬蛋白酶2 (Matrix metalloproteases-2, MMP-2)和MMP-7調(diào)節(jié)細(xì)胞對量子點的攝取，這種酶調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取量子點的方法在腫瘤細(xì)胞成像和選擇性藥物傳遞中有潛在的應(yīng)用價值。這些研究表明，結(jié)合靶向分子的量子點載體可將藥物或者功能蛋白、基因等定向定點帶到腫瘤部位，使非腫瘤組織免受藥物的毒害。還有研究人員通過合成CdSe/ZnS量子點來識別抑癌基因p53，這可能會為腫瘤的治療和診斷提供一些潛在方法[47]。另有研究者用包裹TPGS的量子點脂質(zhì)體共傳遞治療劑和成像劑，可實現(xiàn)對乳腺癌的同時成像和治療[48]。對異種移植乳腺癌小鼠的體內(nèi)研究表明，抗GRP78 scFv-量子點可以抑制腫瘤的生長[49]。這些研究都為腫瘤治療提供了新途徑。

此外，量子點對于腫瘤分期的判定也具有一定借鑒意義，這樣可對不同分期的腫瘤實施不同的診治辦法[11]。利用量子點的光學(xué)特性，使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(Bioluminescence resonance energy transfer,BRET)也可實現(xiàn)對腫瘤的成像和治療[50]。

1.4 量子點的生物安全性

為了使量子點在疾病診斷和治療中發(fā)揮最大優(yōu)勢，其生物安全性是關(guān)鍵所在。量子點的毒性是最大的生物安全隱患，它對生物體表現(xiàn)出不同程度的毒性。如有研究發(fā)現(xiàn)：CdHgTe QDs和CdTe QDs對體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞 MCF7、MBA-MD-231和前列腺癌細(xì)胞PC3都有細(xì)胞毒性；給小鼠體內(nèi)注射時，CdHgTe QDs在注射位點很快被清除，而CdTe QDs在注射后18 d依然可檢出，直到第30天才被清除[4]。Choi等[51]研究證實量子點通過引起脂肪上調(diào)和脂質(zhì)過氧化造成人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的死亡。Ambrosone等[52]也發(fā)現(xiàn)用量子點碲化鎘治療腫瘤影響繁殖、再生、細(xì)胞增殖、并產(chǎn)生遺傳毒性作用，如染色體碎片，基因表達譜的改變。盡管專家們對納米粒子的細(xì)胞毒性研究興趣顯著飆升，但目前對其毒性機制的認(rèn)識還不明確，對其遺傳毒性研究更缺乏明顯的基因形態(tài)學(xué)損害的證據(jù)。現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，納米材料通過刺激細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生自由基并干擾機體抗氧化防御機制，使得脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致細(xì)胞膜損害。

為減小量子點的毒性，增加其生物安全性，研究者在其性能改良上做了不少工作。有綜合研究數(shù)據(jù)表明，在乳腺癌成像中，抗-Her-2抗體包被的量子點具有很好的生物相容性，提示抗體表層可能可以控制量子點的不利影響[20]。最近有課題組對鎘系量子點的細(xì)胞毒性和作用機制作了系統(tǒng)的討論，并為系統(tǒng)理解量子點的生物安全性問題提供了新的機制，有望在量子點的醫(yī)學(xué)應(yīng)用中起到指導(dǎo)作用。他們的研究結(jié)果顯示量子點在細(xì)胞內(nèi)的不均一分布模式產(chǎn)生了顯著的納米效應(yīng)，使細(xì)胞核周圍的鎘離子濃度遠高于其他位置，而量子點表面與尚未游離的鎘離子可能通過與細(xì)胞核的直接接觸產(chǎn)生細(xì)胞毒性[53]。如果確定重金屬成分在量子點毒性中的作用微乎其微，那么量子點將比其他納米材料作為臨床造影劑更有優(yōu)勢[13]。細(xì)胞攝取量子點的研究結(jié)果對了解量子點和納米材料的細(xì)胞毒性也很重要[54]，這樣就可通過對量子點進行多功能設(shè)計來提高其生物安全性。目前主要通過3種基本方法來設(shè)計生物相容性的量子點：連接抗體、結(jié)合多肽和偶聯(lián)其他小分子[55]。此外，還可對量子點進行各種方式的包被 (表2)，增加其生物相容性[35,56]。

1.5 量子點的多功能設(shè)計

在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，為了避免量子點聚合，增強其水溶性及生物相容性，發(fā)揮特定的化學(xué)表面靶向細(xì)胞和藥物傳遞功能，目前已研究發(fā)展了多種結(jié)構(gòu)的量子點，如：核-層結(jié)構(gòu)、有機分子修飾的幾何構(gòu)象及功能化包被結(jié)構(gòu)等[4]。然而，若將量子點由科學(xué)研究轉(zhuǎn)入生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其生物毒性和毒性清除不容忽視。這 2個問題目前還未有深入研究，但又必須認(rèn)真評估。為此，有研究者用硅、PEG等材料對量子點包被，形成了生物相容性良好的功能量子點 (表2)。PEG修飾的量子點可以有效地將非特異性量子點阻止在細(xì)胞外，表面包被羧基的量子點可以快速大量地進入癌細(xì)胞和正常細(xì)胞[54]。所以可根據(jù)不同需要對量子點進行不同材料的包被，增加其生物相容性，提高其在疾病診斷和治療中的安全性。

細(xì)胞攝取量子點主要涉及 3個階段：內(nèi)吞作用、早期內(nèi)涵體封存、內(nèi)涵體或溶酶體轉(zhuǎn)運(圖 2)。細(xì)胞對量子點的內(nèi)吞作用可能是由帶負(fù)電荷的受體協(xié)助的，這樣可減少非特異性定位，從而提高量子點在癌癥診斷和治療應(yīng)用中的具體目標(biāo)[54]。據(jù)此，現(xiàn)已設(shè)計出多種功能化量子點親和性探針 (表2)，這類探針可以更好地實現(xiàn)細(xì)胞靶向。

此外，表2中也總結(jié)了以量子點傳感器為應(yīng)用方向的設(shè)計示例，這樣的功能化修飾對量子點用于生物檢測領(lǐng)域有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖2 量子點的吞噬過程。細(xì)胞攝取量子點包括3個主要過程：內(nèi)吞、進入內(nèi)涵體、轉(zhuǎn)入溶酶體 (基于文獻[13]繪制)Fig. 2 The phagocytic process of QDs. Cellular uptaking of QDs involves three major stages:endocytosis, sequestration in endosomes, and translocation to lysosomes (Based on Ref. [13]).

表2 多功能量子點設(shè)計Table 2 Design of Multifunctional QDs

2 挑戰(zhàn)與展望

在臨床應(yīng)用中，增強量子點穩(wěn)定性和敏感性，使特異性最大化、毒性最小化等是急需解決的問題。研究者發(fā)現(xiàn)明膠及硅包被的量子點可減小細(xì)胞毒性[15,35]。另有實驗人員對辛胺-聚丙烯酸修飾的量子點 (Octylamine-poly(acrylic acid)-QDs, OPA-QDs)進行的細(xì)胞毒性實驗表明，量子點的細(xì)胞毒性因細(xì)胞而異，低濃度的OPA-QDs對人黑色素瘤細(xì)胞A375和A375.S2表現(xiàn)出極大毒性，而很高濃度的OPA-QDs對角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT幾乎沒有什么毒性。同時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗氧化劑 (如天然產(chǎn)物水飛薊素 (Silibinin)，提取自乳草屬植物荊草 (Milkweed thistle)，具有抗氧化性)預(yù)處理，可以減小量子點的細(xì)胞毒性[58]。雙親性聚合物及親水性巰基包被的量子點生物相容性良好，我們可以考慮采取表面修飾的方法降低甚至消除量子點的毒性，增加其生物安全性，以期能更好地應(yīng)用于腫瘤診治中。

在腫瘤診斷、治療和預(yù)后中，生物結(jié)合的量子點可以用來識別分子標(biāo)志物，這使得外科醫(yī)生正確定位淋巴結(jié)、徹底切除腫瘤組織成為可能。Kantelhardt等[29]利用EGFR結(jié)合的靶向量子點探針在低分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織活檢樣本中清晰地區(qū)分出腫瘤細(xì)胞，而增強的-MRI成像系統(tǒng)也不曾區(qū)分出來，這彰顯出量子點探針的強大應(yīng)用前景：在以后的手術(shù)中，這種特異的靶向熒光探針可以為徹底切除腫瘤細(xì)胞提供術(shù)前指導(dǎo)，以提高患者生存率。量子點有望成為可同步進行腫瘤診斷、靶向和治療的一種有效材料。可見，量子點結(jié)合腫瘤標(biāo)志物進行蛋白靶向是腫瘤早期診斷和治療的發(fā)展方向[25,59]。

手術(shù)治療是目前治療腫瘤的主要手段，量子點在腫瘤治療中除了作為分子成像劑外，還可以用于檢測腫瘤轉(zhuǎn)移、示蹤循環(huán)腫瘤細(xì)胞及循環(huán)腫瘤干細(xì)胞、攜帶不同藥物至病變組織、作為示蹤物控制藥物傳遞效率、非侵入性實時研究藥劑的藥代動力學(xué)、識別和定量一系列的腫瘤分子標(biāo)志、通過熒光成像實時定位早期腫瘤和潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移、尋找未徹底切除的腫瘤細(xì)胞、定位SLN；利用量子點深成像能力，通過磁共振成像發(fā)現(xiàn)極小的腫瘤，完全切除病變組織和細(xì)胞。此外，個性化醫(yī)療也是量子點發(fā)展的一個新方向[60]，因腫瘤的異質(zhì)性每個腫瘤患者的情況都不相同，據(jù)此開展個性化醫(yī)療也是一種必然。由此可見，功能化量子點在腫瘤診治中的潛力巨大，非常具進一步探索開發(fā)的研究價值。

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