趙莉萍，梅 俏，胡詠梅，許建明，姚 強

（1.安徽淮北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽 淮北 235000；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化病重點實驗室，安徽 合肥 230022）

雙氯芬酸鈉（diclof enac，DCF）是一種常見的非甾 體 類 抗 炎 藥 （nonsteroidal anti－inflammatory dr ugs，NSAID），具有強效解熱、止痛和抗炎作用，臨床應(yīng)用廣泛，但也可引起多種不良反應(yīng)如肝損傷等。據(jù)臨床統(tǒng)計，最常引起藥物性肝損傷的NSAID之一為DCF。國外報道，有超過1%服用DCF的患者可出現(xiàn)肝損傷反應(yīng)，多表現(xiàn)為急性肝炎癥狀，如食欲缺乏、乏力和惡心等，嚴重者可出現(xiàn)黃疸，其中因重癥肝損傷導(dǎo)致的死亡率約為10%［1－3］。目前DCF引起急性肝損傷的機制尚未完全明確，以往研究認為可能與直接肝細胞毒性和超敏反應(yīng)有關(guān)，后有研究發(fā)現(xiàn)，DCF經(jīng)肝代謝轉(zhuǎn)化形成5－羥基DCF，后者可引起肝細胞內(nèi)ATP不足、線粒體膜電位降低和線粒體功能障礙，還可通過促進氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，消耗谷胱甘肽（glutathione，GSH）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine nucleotide，NADH），促進肝細胞損傷［4－5］。近年研究認為，一氧化氮（nitric oxide，NO）可能也在DCF肝損傷過程中發(fā)揮重要作用［6］。

NO是一種活性很強的自由基，體內(nèi)由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）以L－精氨酸為底物合成，有關(guān)NO在肝損傷中的作用一直存在爭議。有學(xué)者認為，誘導(dǎo)型NOS（i NOS）誘導(dǎo)產(chǎn)生并持續(xù)釋放的NO在肝細胞損傷中起某種損害因子的作用［7－8］，在酒精性肝損傷和替諾昔康（tenoxicam）肝損傷動物模型中NO起促進作用，并認為由i NOS產(chǎn)生的過量NO與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子（ONOO－），可使細胞膜脂質(zhì)過氧化，干擾線粒體電子傳遞，導(dǎo)致肝損傷，NOS抑制劑可減輕其肝損傷程度。另有研究發(fā)現(xiàn)，NO可減輕對乙酰氨基酚（acetaminophen）引起的急性肝損傷［9］，提示NO又具有肝保護作用。本研究制備大鼠急性DCF藥物性肝損傷模型，通過應(yīng)用NOS抑制劑N－硝基－L－精氨酸甲酯（NG－nitro－L－arginine methyl ester，L－NAME）抑制體內(nèi)NO合成，探討NO在DCF致肝損傷中的作用和可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物和試劑

SD大鼠24只，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量220～260 g，南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCRT（蘇）2001－2005，飼養(yǎng)1周后使用。DCF、L－NAME和羅丹明123為美國Sigma公司產(chǎn)品，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、GSH、還原型谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、NO、i NOS、線 粒 體 ATP酶、NADH及線粒體琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 DCF肝損傷動物模型的制備

SD大鼠隨機分為正常對照、DCF模型、DCF＋L－NA ME 2，10和50 mg·kg－1組，每組8只。參照文獻［10］方法，大鼠禁食12 h，自由飲水，DCF模型組一次性ip給予DCF100 mg·kg－1。正常對照組予以等體積生理鹽水。DCF＋L－NA ME組在給DCF前10 min分別一次性ip給予L－NA ME 2，10和50 mg·kg－1。

1.3 血清GPT，GOT，TBIL和NO水平及肝勻漿NO，MDA，MPO，GSH，GSH－Px和SOD水平測定

給L－NA ME 24 h后，各組大鼠ip給予10%水合氯醛麻醉，分離腹主動脈取血，提取血清，用全自動生化分析儀檢測血清GPT，GOT，TBIL和NO水平。稱1 g肝組織加冰生理鹽水制成10%肝勻漿，用相應(yīng)試劑盒檢測NO，MDA，MPO，GSH，GSH－Px和SOD在肝勻漿中的水平。

1.4 肝組織病理學(xué)檢測和肝組織i NOS的測定

肉眼觀察肝外觀形態(tài)，切取小塊肝組織，甲醛固定，常規(guī)包埋切片，進行HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)改變，用半定量法對肝組織病變程度進行積分［11］，根據(jù)各種病變乘以不同加權(quán)數(shù)（各級細胞的數(shù)目乘以該級的得分值），計算每只大鼠肝組織病變的總積分。SP免疫組化法檢測肝組織i NOS的表達，細胞漿染色呈棕黃色者為陽性，用全自動圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，每個標(biāo)本選取3張切片，每張切片隨機選取5個視野，光鏡放大400倍測其積分吸光度（integrated absor bance，IA）值，求平均值，IA值越大表示待測蛋白表達越強。

1.5 肝線粒體膜電位、腫脹度及NADH水平、SDH和ATP酶活性測定

進行肝灌流，迅速分離肝組織，稱取1 g肝組織置于預(yù)冷的蔗糖0.25 mol·L－1溶液中，1 g肝組織加9 ml線粒體分離液，低溫下用組織研磨器制成10%肝勻漿。置于高速低溫離心機上600×g離心10 min，棄沉淀，提取上清液15 000×g離心10 min，獲得沉淀物，再次洗滌沉淀物去除EGTA，15 000×g離心5 min，棄上清液，即獲取線粒體沉淀，置于液氮中保存［12］，用考馬斯亮藍法測定線粒體蛋白質(zhì)濃度。采用羅丹明方法［13］檢測線粒體膜電位，520 nm處吸光度降低值（ΔA520nm）表示線粒體腫脹度。NADH水平用熒光光度計檢測自體熒光值。線粒體SDH及ATP酶活性按試劑盒操作要求進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 L－NAME對DCF致肝損傷大鼠血清GPT，GOT和TBIL水平及肝組織病理變化的影響

與正常對照組比較，DCF模型組大鼠注射DCF 24 h后，血清GPT，GOT和TBIL水平明顯增高（P＜0.01）（表1），肉眼見肝明顯充血腫大，鏡下見肝小葉內(nèi)炎癥細胞浸潤，肝細胞腫脹壞死（圖1B），肝損傷積分升高（表2），提示造模成功。給予L－NA ME 2，10和50 mg·kg－1血清 GPT、GOT和TBIL水平較模型組明顯降低（P＜0.05）（表1），肝小葉內(nèi)炎癥細胞浸潤及壞死程度明顯改善（圖1C，D，E），病理積分明顯降低（P＜0.01）（表2），提示LNA ME可改善肝細胞損傷和壞死。

Tab.1 Effect of N G－nitro－L－arginine methyl ester（L－NAME）on serum levels of glutamic pyruvic transaminase（GPT），glutamic oxalacetic tr ansaminase（GOT）and total bilir ubin（TBIL）in rats with acute liver injury induced by diclofenac（DCF）

Fig.1 Effect of L－NAME on liver mor phological changes in rats with acute liver injury induced by DCF（HE staining）.See Tab.1 f or t he rat treat ment.A：nor mal contr ol group；B.DCF model gr oup；C，D and E：DCF＋L－NA ME 2，10 and 50 mg·kg－1 gr oups，respectively.Arrows show necr osis or infla mmation.

Tab.2 Effect of L－NAME on score of liver injur y of r ats with acute liver injury induced by DCF

2.2 L－NAME對DCF致肝損傷大鼠NO含量和肝組織iNOS表達的影響

由表3、圖2和圖3可以看出，與正常對照組比較，DCF模型組大鼠血清和肝勻漿NO含量明顯增高（P＜0.01），大鼠肝組織i NOS呈高表達（P＜0.01）。DCF＋L－NA ME各組血清NO含量分別降低31.3%，41.2%和46.6%（P＜0.05，P＜0.01），肝勻漿 NO含量分別降低37.0%，55.6%和60.0%（P＜0.05，P＜0.01），大鼠肝組織iNOS表達降低（P＜0.05，P＜0.01），與上述轉(zhuǎn)氨酶變化趨勢一致，提示DCF導(dǎo)致肝損傷與NO有關(guān)，L－NA ME可能通過抑制i NOS表達和減少NO生成，從而減輕DCF誘導(dǎo)的肝損傷。

Tab.3 Effect of L－NAME on content of nitric oxide（NO）in serum and liver tissue of rats with acute liver injury induced by DCF

Fig.2 Effect of L－NAME on expression of inducible nitric oxide synthase（i NOS）in liver tissue of rats with acute liver injury induced by DCF（Immunostaining）.See Tab.1 for the rat treat ment.A：nor mal control group；B：DCF model group；C，D and E：DCF＋L－NA ME 2，10 and 50 mg·kg－1 groups，respectively.Arrows show positive expression of i NOS.

Fig.3 Effect of L－NAME on expression of i NOS in liver tissue of rats with acute liver injury induced by DCF.See Tab.1 f or the rat treat ment.This was the semiquantitive result of Fig.2 with integrated absorbance（IA）by i mage－pro pl us 6.0 analysis.±s，n＝8.＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal contr ol group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，co mpared wit h DCF model gr oup.

2.3 L－NAME對DCF致肝損傷大鼠肝組織勻漿中MPO，MDA和GSH水平及SOD和GSH－PX活性的影響

由表4可以看出，與正常對照組比較，DCF模型組MDA水平明顯增高，GSH水平、GSH－PX和SOD活性明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），提示DCF可致大鼠較嚴重的氧化損傷；L－NA ME 10和50 mg·kg－1均可降低MDA水平，增加GSH水平及SOD和GSH－PX活性（P＜0.05，P＜0.01），表明 LNA ME具有抗氧化損傷和抑制脂質(zhì)過氧化作用。

由表4還可以看出，DCF模型組MPO水平較正常對照組明顯增高（P＜0.05），反映肝組織炎癥細胞浸潤明顯；L－NA ME各組MPO水平明顯降低（P＜0.05），表明 L－NAME可抑制 DCF誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

2.4 L－NAME對DCF致肝損傷大鼠肝線粒體膜電位和腫脹度的影響

由圖4可見，正常對照組線粒體加入反應(yīng)液30 s后，熒光強度值明顯降低，DCF模型組熒光強度值下降幅度較小，說明線粒體對羅丹明123的攝取低于正常對照組（P＜0.01），提示線粒體膜電位異常；DCF＋L－NA ME各劑量組線粒體加入反應(yīng)液30 s后，熒光強度值較DCF模型組升高（P＜0.05，P＜0.01），提示恢復(fù)至正常的膜電位。由圖5可以看出，線粒體分別加入p H 7.2和CaCl2的緩沖液后，正常對照組△A520nm顯著下降，DCF模型組△A520nm低于正常對照組（P＜0.01），提示線粒體對環(huán)境變化不敏感，線粒體功能損傷。加入p H 7.2液后，DCF＋L－NA ME 50 mg·kg－1組ΔA520nm較 DCF模型組升高（P＜0.05），提示線粒體腫脹的敏感性也顯著提升，提示受損線粒體的功能明顯改善。

Fig.4 Effect of L－NAME on mitochondria membrane potential（Δψ）of liver in rats with acute liver injury induced by DCF.See Tab.1 f or the rat treat ment.Twenty－four hours after administration of DCF，the uptake of r hodamine（R123）by liver mitochondria was detected.±s，n＝8.＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal contr ol gr oup；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，co mpared wit h DCF model group.

Tab.4 Effect of L－NAME on level of malondialdehyde（MDA），reduced glutathione（GSH），myeloper oxidase（MPO）and activity of super oxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH－PX）in liver tissue of rats with acute liver injury induced by DCF

Fig.5 Effect o L－NAME on mitochondrial swelling of the liver in rats with acute liver injury induced by DCF.See Tab.1 for the rat treat ment.Twenty－four hours after ad ministration of DCF，isolated mitochondria were suspended in assay mediu m and changes in absorbance at 520 n m（ΔA520 nm）were measured.A：ΔA 520 n m after addition of reaction buffer（p H 7.2）；B：△A 520 n mafter addition of high－level Ca2＋buffer.±s，n＝8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal control group；＃P＜0.05，compared with DCF model group.

2.5 L－NAME對DCF致肝損傷大鼠肝線粒體NADH水平及SDH和ATP酶活性的影響

由表5可以看出，與正常對照組比較，DCF模型組線粒體NADH水平及SDH和ATP酶活性均明顯降低（P＜0.01），提示呼吸鏈電子傳遞的功能減弱，細胞能量生成減少；L－NAME各劑量組NADH水平明顯增加，SDH和ATP酶活性升高（P＜0.05，P＜0.01），提示L－NA ME具有增強線粒體呼吸鏈功能的作用。

3 討論

近年研究認為，NO可能在DCF致肝損傷過程中起重要作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素和對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷動物模型中，i NOS合成NO增加可促進肝損傷；抑制肝組織中i NOS表達可減輕肝損傷［7，14］。特異性i NOS抑制劑預(yù)處理對缺血再灌注性肝損傷也有顯著改善作用［15］。

本研究結(jié)果表明，大鼠ip給予DCF可導(dǎo)致嚴重肝損傷，表現(xiàn)為血清GPT，GOT和TBIL水平顯著增高，病理顯示肝細胞腫脹壞死，伴炎癥細胞浸潤。同時DCF引起血漿和肝勻漿NO水平顯著增高，肝組織i NOS表達增加。L－NA ME 2，10和50 mg·kg－1預(yù)處理可明顯降低肝組織i NOS表達及血清和肝勻漿NO水平，顯著降低血清GPT，GOT和TBIL水平，改善肝組織病理損傷，尤其是以L－NA ME 10和50 mg·kg－1劑量組效果顯著，提示NO對DCF引起的急性肝損傷具有促進作用。

據(jù)報道，NO可與過氧化物結(jié)合生成過氧亞硝酸鹽化合物，是氧化損傷的主要自由基之一［8］。SOD和GSH－Px是機體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)，通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整。本研究結(jié)果表明，L－NA ME可改善DCF引起的肝組織MDA水平增高及GSH，SOD和GSH－Px活性減低，并降低肝組織 MPO水平，提示L－NA ME具有抗氧化作用，抑制炎癥反應(yīng)。

Tab.5 Effect of L－NAME on level of nicotinamide adenine dinucleotide－reduced（NADH）and activity of adenosine triphosphatase（ATPase），succinate dehydrogenase（SDH）of mitochondria in liver tissue of r ats with acute liver injury induced by DCF

線粒體是細胞能量的合成場所，是NO細胞毒性作用的重要靶標(biāo)。DCF可引起線粒體呼吸鏈與氧化磷酸化解耦聯(lián)，抑制ATP酶活性，ATP合成下降，導(dǎo)致肝能量代謝紊亂，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道開放［17］。本研究結(jié)果表明，DCF模型組大鼠線粒體中NADH，SDH及ATP酶活性顯著降低，提示DCF抑制線粒體呼吸鏈功能，引起肝細胞損傷，這與以往有關(guān)NSAID性肝損傷發(fā)病機制之一是ATP能量耗竭的結(jié)論一致［18］。另外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，LNA ME可提高線粒體NADH水平以及SDH和ATP酶活性，L－NA ME 10和50 mg·kg－1作用更加明顯，提示NO對線粒體呼吸鏈功能具有重要作用。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道開放可引起線粒體腫脹［17］，線粒體膜電位變化幅度可反映線粒體功能的完整性。本研究結(jié)果表明，DCF模型組肝線粒體膜電位變化幅度以及對p H 7.2和高鈣溶液引起線粒體腫脹的敏感性明顯低于正常對照組，提示線粒體功能損傷嚴重。－NAME可恢復(fù)線粒體膜電位變化幅度，維持線粒體腫脹的敏感性，明顯改善肝線粒體功能。

綜上所述，NO可促進DCF引起的急性肝損傷過程，作用機制可能與促進細胞氧化損傷、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道開放及干擾線粒體能量代謝有關(guān)。

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