孟玉生等

[摘要] 目的 研究涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織和涎腺炎癥中人β-防御素-2（HBD-2）mRNA和蛋白的表達(dá)特征。方法 對不同涎腺組織，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實時聚合酶鏈反應(yīng)（Real-Time PCR）和免疫組化檢測HBD-2的表達(dá)，并分析HBD-2 mRNA和蛋白在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中的表達(dá)差異。結(jié)果 與涎腺正常組織比較，良性腫瘤組HBD-2 mRNA表達(dá)量為其6.468倍，顯著高于涎腺正常組織組（P<0.05）；惡性腫瘤組為其0.334倍，顯著低于涎腺正常組織組（P<0.05）；涎腺炎癥組為其10.563倍，顯著高于涎腺正常組織組（P<0.05）。HBD-2不僅在這些組織的細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)，而且在惡性組織中的細(xì)胞核也有表達(dá)。結(jié)論 HBD-2在涎腺良性腫瘤組織及涎腺炎癥組織中高表達(dá)，在涎腺惡性腫瘤組織中低表達(dá)，其蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 人β-防御素-2； 涎腺腫瘤； 涎腺炎癥

[中圖分類號] Q 786 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.017

在我國涎腺腫瘤占人頭頸部腫瘤的2%～3%[1]，發(fā)病率比較高，常發(fā)生在主要的腺體中。β-防御素屬于抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），在天然免疫過程中表現(xiàn)多種作用，屬于固有免疫系統(tǒng)，對于抗原呈遞的樹突細(xì)胞具有誘導(dǎo)刺激作用[2]。最近人β-防御素-2（human beta-defensin-2，HBD-2）被認(rèn)為是位于染色體8p23上的備用腫瘤抑制基因，HBD-2基因在一系列細(xì)胞中的超表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡蛋白-3調(diào)控細(xì)胞凋亡或者是細(xì)胞的完全死亡通過特殊的細(xì)胞表面受體來調(diào)節(jié)[3]。HBD-2首先在牛皮癬患者的皮膚中被發(fā)現(xiàn)，還表達(dá)于包皮、肺、氣管、口腔黏膜等組織[4]，HBD-2通過上皮表面分泌的一種小的可溶縮氨酸發(fā)揮抗菌作用。HBD-2能被細(xì)菌、細(xì)菌毒性產(chǎn)物以及諸如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-

1β、IL-16、IL-8或者腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等細(xì)胞因子誘導(dǎo)，此外合成的HBD-

2能抑制膀胱癌細(xì)胞系TSU-Pr1的增殖，可導(dǎo)致腎癌細(xì)胞的凋亡[5]。在90%的腎癌細(xì)胞和82%的惡性前列腺癌中都發(fā)現(xiàn)有HBD-2的減少，而在良性的上皮瘤中有持續(xù)的高表達(dá)[6]。本實驗旨在研究HBD-2 mRNA和蛋白在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中的表達(dá)情況，及其在這些中的表達(dá)位置。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

Trizol（Gibco公司，美國），PrimeScript RT MasterMix、PremixTaq Version2.0、實時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，Real-Time PCR）SYBR Premix Ex Taq（Takara公司，日本），免疫組織化學(xué)試劑盒（Invitrogeng公司，美國），SP免疫組化試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

實驗引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。HBD-2的上游引物：5-CATGAGGGTCT-TGTATCTCCTCT-3，下游引物：5-CCTCCTCAT-GGCTTTTTGCAGC-3。β-actin的上游引物：5-AA-ACTGGAACGGTGAAGGTG-3， 下游引物：5-AG-TGGGGTGGCTTTTAGGAT-3。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 選取2008—2010年在北京大學(xué)深圳醫(yī)院經(jīng)手術(shù)和病理證實的涎腺良性腫瘤標(biāo)本32例，其中男19例，女13例，平均年齡45.7歲。正常涎腺標(biāo)本23例，其中男13例，女10例，平均年齡43.5歲。惡性腫瘤標(biāo)本10例，其中男6例，女4例，平均年齡57.6歲。炎癥標(biāo)本16例，其中男10例，女6例，平均年齡52.9歲。所選標(biāo)本一份保存于液氮中，用于提取RNA；一份以4%多聚甲醛固定，4 ℃存放，用于免疫組化檢測。以上標(biāo)本的獲得均取得患者知情同意。

1.2.2 HBD-2在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中的表達(dá) 用Trizol法從各個標(biāo)本中提取mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；將cDNA用于PremixTaq Ver-sion2.0試劑做PCR分析表達(dá)情況。并將cDNA用于Real-Time PCR，定量檢測HBD-2 mRNA表達(dá)，具體的步驟參照試劑盒說明。Real-Time PCR條件：

95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min。對HBD-2以及內(nèi)參照β-actin分別進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，PCR定量計算mRNA，待測樣品中的表達(dá)量用2-△Ct表示，2-△Ct = 2-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。

1.2.3 免疫組化 所有的切片均經(jīng)光學(xué)顯微鏡下盲法評分。隨機(jī)選擇5個高倍鏡視野（×400）進(jìn)行判斷，以腫瘤細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行腫瘤細(xì)胞陽性計分，2個分值相加即為該標(biāo)本的免疫組化陽性計分，具體如下。1）陰性表達(dá)或無表達(dá)：0～1分；2）弱陽性：2～3分；3）陽性：4～5分；4）強(qiáng)陽性：6～7分。染色強(qiáng)度評分：0分為無色；1分為細(xì)胞染色呈淺黃色；2分為細(xì)胞呈黃色；3分為細(xì)胞呈棕褐色。陽性細(xì)胞比例：1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；76%～100%為4分。規(guī)定積分≥3分為陽性，無陽性細(xì)胞表達(dá)為0。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對Real-Time PCR結(jié)果采用χ2檢驗分析，采用Fishers exact test計算免疫組化評分結(jié)果，并采用Continuity correction對上述結(jié)果進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 HBD-2的分子檢測

PCR結(jié)果顯示，在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中均可檢測到HBD-2 mRNA（圖1）。

1：Marker；2：良性腫瘤組織；3：惡性腫瘤組織；4：炎癥組織；5：正常涎腺組織。

圖 1 涎腺腫瘤組織、炎癥組織和正常涎腺組織中均見HBD-2

的表達(dá)

Fig 1 The expression of HBD-2 in tumor tissue， inflammation tis-

sue and normal salary gland tissue

Real-Time PCR結(jié)果顯示，與正常涎腺組織組比較，良性腫瘤組HBD-2 mRNA表達(dá)量為其6.468倍，顯著高于正常涎腺組織組（P<0.05）；惡性腫瘤組為其0.334倍，顯著低于正常涎腺組織組（P<0.05）；炎癥組織組為其10.563倍，顯著高于正常涎腺組織組（P<0.05）（圖2）。

圖 2 HBD-2 mRNA在涎腺良性腫瘤組織、惡性腫瘤組織、炎

癥組織和正常涎腺組織中的表達(dá)

Fig 2 The expression of HBD-2 mRNA in salary gland benign tu-

mor， cancer and inflammation tissue and normal salary

gland tissue

2.2 HBD-2在不同涎腺組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，HBD-2蛋白表達(dá)于表皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，正常涎腺組織、涎腺良性腫瘤組織和炎癥組織中皆可檢測到HBD-2表達(dá)，但在涎腺惡性腫瘤中陰性表達(dá)常見。與正常涎腺組織比較，惡性腫瘤組織HBD-2表達(dá)顯著降低；炎癥組織和良性腫瘤組織HBD-2表達(dá)顯著增強(qiáng)，表達(dá)見于細(xì)胞漿區(qū)（圖3）。將HBD-2陰性表達(dá)和弱陽性表達(dá)限定為低表達(dá)，統(tǒng)計結(jié)果顯示，HBD-2在涎腺惡性腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于正常組織（P<0.05），并且其表達(dá)不僅局限于細(xì)胞漿中，在細(xì)胞核中也有發(fā)現(xiàn)。HBD-2蛋白在涎腺正常組織、炎癥組織、良性腫瘤和惡性腫瘤組織中的表達(dá)情況見表1。

3 討論

存在于人體的防御素分為兩類，分別為α-防御素和β-防御素，HBD-2是β-防御素中的一種[7]。防御素在天然免疫功能中表現(xiàn)多種作用，一些報道暗示人類的HBD具有潛在腫瘤抑制作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)相對于正常組織，炎癥組織HBD-2 mRNA的表達(dá)量為其10.563倍，良性腺瘤中HBD-2 mRNA的表達(dá)量為其6.468倍，而在惡性腫瘤中其表達(dá)有所下降。免疫組化顯示，相對于正常組織，炎癥組織、良性腫瘤中HBD-2的表達(dá)水平有所上升，惡性腫瘤HBD-2表達(dá)有所下降；不僅表達(dá)量有變化，表達(dá)位置也有改變，正常組織、炎癥組織和良性腫瘤中HBD-2僅出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，而惡性腫瘤中其在細(xì)胞質(zhì)和胞核中都有表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明HBD-2可能與涎腺炎癥或發(fā)生腫瘤時微生物感染、炎癥因子的持續(xù)刺激、機(jī)體為了抵抗微生物入侵[9]、上調(diào)HBD-2表達(dá)有關(guān)。有研究[10]表明， HBD-2的表達(dá)可能由炎癥刺激因素誘導(dǎo)產(chǎn)生；其次在惡性涎腺腫瘤中除了基因改變外，它也有可能是一種抑制劑，這些都可能在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮潛在作用。HBD-2作為機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的組成部分，與某些炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)展有密切的關(guān)系。研究[11]發(fā)現(xiàn)防御素能夠裂解腫瘤細(xì)胞，其裂解作用與防御素濃度密切相關(guān)，溫度下降或有血清存在時被抑制；發(fā)現(xiàn)鼠惡性畸胎瘤細(xì)胞在體外經(jīng)人中性粒細(xì)胞多肽作用后，回移體內(nèi)喪失致瘤性[12]。目前已在多種組織的腫瘤中檢測出防御素的表達(dá)[13]。

在研究防御素與口腔疾病的關(guān)系時，防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用，與多種口腔黏膜疾?。谇粷?、扁平苔蘚、白斑及口腔白色假絲酵母菌等）關(guān)系密切[14]，口腔內(nèi)齲齒的發(fā)生也與β-防御素的表達(dá)有關(guān)[15]。

在口腔腫瘤學(xué)方面，Abiko等[16]報道在涎腺角化腫瘤中的HBD縮氨酸意味著腺管細(xì)胞在炎癥和癌癥的角化作用情況下發(fā)生了鱗狀上皮化生。此外Sawaki等[17]曾經(jīng)報道口腔鱗狀細(xì)胞癌有HBD-2存在并且其濃度水平高，部分HBD-2濃度高的患者術(shù)后預(yù)后較好，有些濃度低的患者可發(fā)生3年內(nèi)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。Wenghoefer等[18]發(fā)現(xiàn)很多口腔病變中HBD-2減少，但在口腔鱗狀上皮癌中有所增加，認(rèn)為HBD-2在調(diào)控口腔鱗癌凋亡的轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)中扮演著重要角色。

筆者目前的研究表明：在惡性涎腺腫瘤與正常組織、涎腺炎癥組織和良性腫瘤的比較中，HBD-2基因和蛋白表達(dá)下降，HBD-2蛋白發(fā)生從胞質(zhì)到胞核的表達(dá)改變。雖然到目前為止這種蛋白核轉(zhuǎn)移的原因和生物學(xué)影響都還未知，但是HBD-2在細(xì)胞核中的聚集似乎導(dǎo)致了基因表達(dá)下降，這些都可能在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮潛在的作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 于世鳳. 口腔組織病理學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 2003：227.

Yu Shifeng. Oral pathology[M]. Beijing： Peoples Medical Publishing House， 2003： 227.

[2] Kutta H， May J， Jaehne M， et al. Antimicrobial defence mechanisms of the human parotid duct[J]. J Anat， 2006， 208（5）：609-619.

[3] Sun CQ， Arnold R， Fernandez-Golarz C， et al. Human beta-defensin-1， a potential chromosome 8p tumor suppressor： control of transcription and induction of apoptosis in renal cell carcinoma[J]. Cancer Res， 2006， 66（17）：8542-8549.

[4] Dankof A， Morawietz L， Feist E. Labial salivary gland bio-psy in Sj?grens syndrome[J]. Pathologe， 2006， 27（6）：416-421.

[5] Steubesand N， Kiehne K， Brunke G， et al. The expression of the beta-defensins hBD-2 and hBD-3 is differentially regulated by NF-kappaB and MAPK/AP-1 pathways in an in vitro model of Candida esophagitis[J]. BMC Immunol， 2009， 10：36.

[6] Donald CD， Sun CQ， Lim SD， et al. Cancer-specific loss of beta-defensin 1 in renal and prostatic carcinomas[J]. Lab Invest， 2003， 83（4）：501-505.

[7] Lichtenstein A， Ganz T， Selsted ME， et al. In vitro tumor cell cytolysis mediated by peptide defensins of human and rabbit granulocytes[J]. Blood， 1986， 68（6）：1407-1410.

[8] Shestakova T， Zhuravel E， Bolgova L， et al. Immunohisto-chemical analysis of beta-defensin-2 expression in human lung tumors[J]. Exp Oncol， 2010， 32（4）：273-276.

[9] Klüver E， Adermann K， Schulz A. Synthesis and structure-activity relationship of beta-defensins， multi-functional pep-tides of the immune system[J]. J Pept Sci， 2006， 12（4）：243-

257.

[10] Bissell J， Joly S， Johnson GK， et al. Expression of beta-defensins in gingival health and in periodontal disease[J]. J Oral Pathol Med， 2004， 33（5）：278-285.

[11] Dommisch H， Winter J， Willebrand C， et al. Immune regu-latory functions of human beta-defensin-2 in odontoblast-like cells[J]. Int Endod J， 2007， 40（4）：300-307.

[12] Sahasrabudhe KS， Kimball JR， Morton TH， et al. Expression of the antimicrobial peptide， human beta-defensin 1， in duct cells of minor salivary glands and detection in saliva[J]. J Dent Res， 2000， 79（9）：1669-1674.

[13] Bullard RS， Gibson W， Bose SK， et al. Functional analysis of the host defense peptide Human Beta Defensin-1： new insight into its potential role in cancer[J]. Mol Immunol， 2008， 45（3）：839-848.

[14] Vardar-Sengul S， Demirci T， Sen BH， et al. Human beta defensin-1 and -2 expression in the gingiva of patients with specific periodontal diseases[J]. J Periodontal Res， 2007， 42（5）：429-437.

[15] Joly S， Maze C， McCray PB Jr， et al. Human beta-defensins 2 and 3 demonstrate strain-selective activity against oral microorganisms[J]. J Clin Microbiol， 2004， 42（3）：1024-

1029.

[16] Abiko Y， Nishimura M， Kaku T. Defensins in saliva and the salivary glands[J]. Med Electron Microsc， 2003， 36（4）：

247-252.

[17] Sawaki K， Mizukawa N， Yamaai T， et al. High concentration of beta-defensin-2 in oral squamous cell carcinoma[J]. An-ticancer Res， 2002， 22（4）：2103-2107.

[18] Wenghoefer M， Pantelis A， Dommisch H， et al. Decreased gene expression of human beta-defensin-1 in the develop-ment of squamous cell carcinoma of the oral cavity[J]. Int J Oral Maxillofac Surg， 2008， 37（7）：660-663.

（本文編輯 杜冰）