喬磊???丁仲鵑???張立亞???牛濤

[摘要] 目的 研究微弧氧化鈦表面對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架的影響。方法 將直徑15 mm、厚度1 mm的純鈦片根據(jù)表面處理方法不同分為4組：機(jī)械打磨（G）組、噴砂（SB）組、打磨微弧氧化（GMAO）組和噴砂微弧氧化（SBMAO）組。采用掃描電子顯微鏡（SEM）、激光共聚焦顯微鏡（LSCM）研究鈦片表面成骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況及細(xì)胞骨架的改變。結(jié)果 成骨細(xì)胞接種12 h后，各組細(xì)胞均沿鈦片表面鋪展開，且GMAO組和SBMAO組細(xì)胞覆蓋于火山口狀微孔上。各組肌動(dòng)蛋白纖維清晰可見，GMAO組和SBMAO組肌動(dòng)蛋白纖維平行排列，匯聚成束伸向微孔內(nèi)。結(jié)論 微弧氧化后的鈦表面可以影響成骨細(xì)胞鋪展的形態(tài)及細(xì)胞骨架的排列。

[關(guān)鍵詞] 微弧氧化； 激光共聚焦顯微鏡； 成骨細(xì)胞； 細(xì)胞骨架

[中圖分類號(hào)] R 783.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.006

種植體成功的關(guān)鍵在于形成良好的骨結(jié)合，而成骨細(xì)胞是骨結(jié)合的關(guān)鍵。種植體植入后，成骨細(xì)胞首先在種植體表面黏附、叢集，然后分泌骨基質(zhì)，啟動(dòng)新骨生成。新骨從種植體表面逐漸向骨創(chuàng)面生長(zhǎng)、延伸，最終形成種植體與骨組織的骨結(jié)合。由此可見，提高成骨細(xì)胞的成骨活性是提高種植成功率的有效途徑。目前種植體表面改性的主要方法有表面形貌改性、表面化學(xué)成分改性及表面功能涂層改性。微弧氧化是目前研究中的熱點(diǎn)。有研究[1-3]報(bào)道，微弧氧化表面對(duì)成骨細(xì)胞的黏附、增殖、分化均有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)在打磨和噴砂基礎(chǔ)上，采用微弧氧化法處理鈦片，研究微弧氧化鈦表面對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架（cytoskeleton，CSK）的影響。

1 材料和方法

1.1 鈦片的表面處理和分組

將直徑為15 mm、厚度為1 mm的鈦片，按處理方法不同分為4組：機(jī)械打磨（G）組、噴砂（SB）組、打磨微弧氧化（GMAO）組和噴砂微弧氧化（SBMAO）組。

G組采用機(jī)械打磨方法，依次用防水砂紙240、360、600、800目同向打磨鈦片，使表面光滑，呈金屬光澤，肉眼觀劃痕一致。SB組在機(jī)械打磨的基礎(chǔ)上，使用40～60目的二氧化鈦砂在6.5 kPa、10 cm距離條件下均勻噴砂。GMAO組為將經(jīng)過(guò)機(jī)械打磨的鈦片用丙酮在超聲波清洗機(jī)中清洗，干燥后進(jìn)行微弧氧化。微弧氧化電解液的基本組成成分為20 g·L-1 Ca（CH3COO）2·H2O、9.3 g·L-1 Na5P3O10和Na2SiO3·9H2O，去離子水為溶劑，試劑均為分析純。將鈦片作為陽(yáng)極，不銹鋼電解槽為陰極進(jìn)行微弧氧化。實(shí)驗(yàn)所用的電參數(shù)為：正向電壓350 V，負(fù)向電壓160 V，頻率800 Hz，處理時(shí)間20 min，電解液通過(guò)冷卻水循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行冷卻，微弧氧化過(guò)程中溫度控制為15～

30 ℃。SBMAO組為將經(jīng)過(guò)40～60目噴砂的鈦片用丙酮在超聲波清洗機(jī)中清洗，干燥后進(jìn)行微弧氧化。

1.2 成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)

采用改進(jìn)后的貼壁組織塊分步消化法體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞。

1.3 鈦片表面成骨細(xì)胞的形態(tài)變化

取生長(zhǎng)至第3代的成骨細(xì)胞，無(wú)菌PBS沖洗后0.25%胰酶消化，吹打均勻后調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升4×104個(gè)，用加樣器吸取500 ?L細(xì)胞懸液接種于放有預(yù)置清潔鈦片的24孔板內(nèi)，每組3枚鈦片。當(dāng)分別培養(yǎng)至2、4、12 h后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，室溫加入4%多聚甲醛固定10 min，乙醇梯度脫水（體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，前6種體積分?jǐn)?shù)每種脫水2次，每次3 min，100%體積分?jǐn)?shù)脫水3次，每次3 min），真空干燥，噴金，掃描電子顯微鏡（scanning electron micro-scope，SEM）觀察成骨細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4 鈦片表面成骨細(xì)胞內(nèi)CSK的變化

將接種好成骨細(xì)胞的各組鈦片進(jìn)行異硫氰酸熒光素-鬼筆環(huán)肽（fluorescein isothiocyanate-phalloidin，F(xiàn)ITC-phalloidin）室溫染色60 min，PBS清洗細(xì)胞3次，置于激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）下觀察CSK的微絲形態(tài)變化并拍照。

2 結(jié)果

2.1 鈦片表面成骨細(xì)胞形態(tài)的變化

成骨細(xì)胞接種于鈦片表面不同時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)見圖1。

成骨細(xì)胞接種2 h（圖1第1行），與剛消化下來(lái)時(shí)的圓形細(xì)胞相比，各組細(xì)胞已經(jīng)有明顯的伸展，體積也有增大。G組細(xì)胞向四周伸展，無(wú)方向性，細(xì)胞邊緣與鈦表面結(jié)合緊密。SB組細(xì)胞有選擇性地附于噴砂形成的孔洞內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞足進(jìn)一步伸展攀附于孔洞邊緣，與鈦片粗糙表面結(jié)合緊密。GMAO組細(xì)胞完全平鋪于基底上，周圍細(xì)胞足伸入火山狀孔洞內(nèi)。SBMAO組細(xì)胞完全鋪展開，大部分細(xì)胞位于凹陷處，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞覆蓋于大量火山狀孔洞上，細(xì)胞扁平，甚至可以見到整個(gè)細(xì)胞覆蓋于孔洞之上，周邊細(xì)胞足伸入孔洞內(nèi)，與孔洞結(jié)合緊密。

成骨細(xì)胞接種于鈦片表面4 h（圖1第2行），各組細(xì)胞的體積進(jìn)一步增大。G組細(xì)胞形狀扁平，細(xì)胞長(zhǎng)軸方向與表面劃痕方向一致。SB組細(xì)胞體積已經(jīng)大于表面孔洞，細(xì)胞跨越孔洞凹陷，周邊細(xì)胞足明顯伸入周圍的細(xì)小孔洞內(nèi)。SBMAO組細(xì)胞與SB組一樣跨越孔洞凹陷，周邊細(xì)胞足已經(jīng)完全伸入上下聯(lián)通的孔洞內(nèi)。GMAO組細(xì)胞較SBMAO組更為扁平。

成骨細(xì)胞接種于鈦片表面12 h（圖1第3行），各組細(xì)胞鋪展面積進(jìn)一步增大。G組細(xì)胞沿著表面劃痕方向完全鋪展開。SB組細(xì)胞完全跨越表面孔洞凹陷，位于凹陷上方，周邊細(xì)胞足伸長(zhǎng)更加明顯。GMAO和SBMAO組細(xì)胞之間有偽足相連，細(xì)胞有連接成片的趨勢(shì)，周圍可見伸入孔洞內(nèi)的三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。

2.2 鈦表面對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CSK的影響

成骨細(xì)胞接種于鈦片表面不同時(shí)間的細(xì)胞內(nèi)CSK的微絲形態(tài)見圖2。成骨細(xì)胞接種2 h（圖2第1行），G 組肌動(dòng)蛋白纖維成束狀，有沿打磨形成的劃痕方向鋪展的趨勢(shì)；SB組細(xì)胞陷于噴砂形成的孔洞中，肌動(dòng)蛋白纖維束沿孔洞的邊緣鋪展，形態(tài)不規(guī)則；GMAO和SBMAO組肌動(dòng)蛋白纖維沿小孔邊緣伸展，微絲結(jié)構(gòu)密集且不清晰，兩組的差異不明顯。

成骨細(xì)胞接種4 h（圖2第2行），G組成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維沿劃痕方向生長(zhǎng)，纖維伸長(zhǎng)。SB組肌動(dòng)蛋白纖維沿著表面形態(tài)排列，將細(xì)小的孔洞覆蓋，有的伸入孔洞內(nèi)。GMAO和SBMAO組表面的細(xì)胞均鋪展開生長(zhǎng)，將火山口狀結(jié)構(gòu)覆蓋，火山口處肌動(dòng)蛋白纖維沿火山口形成圈；GMAO組較SBMAO組細(xì)胞的形態(tài)更規(guī)則，類似于G組，而SBMAO組細(xì)胞形態(tài)更近似于SB組。

成骨細(xì)胞接種12 h（圖2第3行），各組細(xì)胞體積均增大，肌動(dòng)蛋白纖維均清晰可見，纖維束平行排列與細(xì)胞長(zhǎng)軸一致。G組肌動(dòng)蛋白纖維束沿劃痕方向排列。SB組細(xì)胞向四周鋪展，肌動(dòng)蛋白纖維沿孔洞邊緣排列，細(xì)胞覆蓋在孔洞上方。GMAO和SBMAO組細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維平行排列，圈形排列的肌動(dòng)蛋白纖維減少，肌動(dòng)蛋白纖維在細(xì)胞邊緣處匯聚成束，伸向孔洞內(nèi)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用LSCM觀察不同鈦片表面對(duì)成骨細(xì)胞CSK的影響。傳統(tǒng)熒光顯微鏡是采用很寬的照明光束照射樣品進(jìn)行觀察，因此存在樣品在焦平面時(shí)的結(jié)構(gòu)能清晰成像，但是在非焦平面的結(jié)構(gòu)成像模糊的問(wèn)題。LSCM采用點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，利用照明針孔與探測(cè)針孔的共軛原理，可以得到連續(xù)的光切圖像，呈現(xiàn)樣品真實(shí)清晰的三維結(jié)構(gòu)[2]。

本文所用抗體FITC-phalloidin能特異性地與聚合態(tài)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合。肌動(dòng)蛋白是微絲的主要成分，參與維持細(xì)胞正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)，以及力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)等多種功能，其結(jié)構(gòu)重排及聚合和解聚的動(dòng)態(tài)變化在一定程度上反映了細(xì)胞的功能狀況。本研究中，成骨細(xì)胞接種于鈦片表面2 h后各組細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維聚集，分布于表面隆起處；接種4 h后，2個(gè)微弧氧化組表面火山口處細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維均沿火山口形成圈，這可能與成骨細(xì)胞分泌的纖連蛋白多集中于表面粗糙孔洞的邊緣處有關(guān)[3]。

整合素分子能特異性地與細(xì)胞外基質(zhì)（extra-cellular matrix，ECM）中的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列結(jié)合，將細(xì)胞外的ECM分子與細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白連接起來(lái)，形成ECM-整合素-CSK黏著斑，傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的雙向信號(hào)[4]。整合素與ECM結(jié)合后就與CSK發(fā)生聯(lián)系，并發(fā)生簇集，從而介導(dǎo)細(xì)胞的黏附和遷移。材料表面經(jīng)處理后，其粗糙度增加，細(xì)胞與材料的接觸面積增大，這樣在植入體內(nèi)后，ECM會(huì)在材料表面形成一層生物大分子層，與細(xì)胞表面的整合素結(jié)合[5]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)微弧氧化處理的鈦片表面的粗糙度明顯高于G組及SB組。當(dāng)成骨細(xì)胞黏附于材料表面后，開始鋪展并伴隨著偽足形成。ECM-整合素-CSK黏著斑在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中重組肌動(dòng)蛋白骨架，細(xì)胞變平并鋪展[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，12 h后各組細(xì)胞均已完全鋪展，細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維排列成束且有規(guī)律，GMAO與SBMAO組均可見細(xì)胞之間的肌動(dòng)蛋白纖維束相互連接，這與SEM觀察到的細(xì)胞有連接成片的趨勢(shì)相一致，提示SBMAO組與GMAO組鈦片表面均有利于成骨細(xì)胞的ECM與整合素結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)胞的黏附和遷移。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞之間的肌動(dòng)蛋白纖維鋪展的差異逐漸減小，到培養(yǎng)12 h時(shí)，肌動(dòng)蛋白纖維的鋪展無(wú)明顯差異，只是2個(gè)微弧氧化組細(xì)胞有連接成片的趨勢(shì)。

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（本文編輯 吳愛華）