朱桂云 楊永輝 安曉穎 康麗菲 陳寧 歐陽琴

我國是結(jié)核病高發(fā)國家之一，每年新增結(jié)核病患者約150萬。在結(jié)核病防治中，我們面臨的最大難題之一就是如何快速準(zhǔn)確地診斷結(jié)核。γ-干擾素釋放試驗(yàn)是一種新的診斷結(jié)核的輔助手段，因其具有較高的敏感性和特異性，已受到臨床越來越廣泛的重視［1］。目前有兩種較為成熟的γ-干擾素釋放試驗(yàn)方法，即酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)［2，3］，本研究選用分別采用這兩種方法的結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)(A.TB)試劑盒和結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(TSPOT.TB)試劑盒進(jìn)行γ-干擾素釋放試驗(yàn)，對比研究檢測結(jié)果的一致性，探討二者的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料隨機(jī)選取2012 年1 至6 月初次在我院住院的臨床診斷為肺結(jié)核和待排除肺結(jié)核的患者70 例，其中男38例，女32 例;年齡22 ～53 歲，平均年齡37.6 歲。70 例患者中有44 例確診為肺結(jié)核(以痰涂片發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌或結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為標(biāo)準(zhǔn))，剩余的26 例均為排除肺結(jié)核的診斷，其中普通細(xì)菌感染引起的肺炎19 例，肺癌4 例，間質(zhì)性肺炎2例，結(jié)節(jié)病1 例。

1.2 儀器與試劑CO2培養(yǎng)箱，水浴鍋，酶標(biāo)儀。T-SPOT.TB試劑盒(英國Oxford Immunotec Ltd 生產(chǎn))，A.TB 試劑盒(?？诰S瑅璦生物研究院生產(chǎn))，RPMI1640 培養(yǎng)液，PBS 緩沖液，AIMV 培養(yǎng)液，淋巴細(xì)胞分離液。

1.3 方法

1.3.1 T-SPOT.TB 檢測:①外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離、收集與計(jì)數(shù):每個(gè)入選病例采集4 ml 外周血標(biāo)本置于肝素鋰抗凝的試管中，立即混勻，在4 h 內(nèi)進(jìn)行PMBC 分離。即加入等體積的RPMI1640 培養(yǎng)液混勻后緩慢加在4 ml 淋巴細(xì)胞分離液上層，2 500 r/min水平離心22 min 后吸取中間層云霧狀細(xì)胞(PMBC)。在PMBC 中加入RPMI 1640 至10 ml，1 900 r/min 水平離心7 min，棄去上清液。加入 AIM-V 培養(yǎng)液至10 ml，1 700 r/min水平離心7 min，棄去上清液。進(jìn)行顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用AIM-V 調(diào)節(jié)剩余細(xì)胞懸液濃度至2.5×106/ml。②體外抗原刺激與孵育:取出試劑盒中的微孔板，1 份標(biāo)本需4 個(gè)孔，分別加入陰性對照AIM-V、抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)、陽性對照植物凝集素PHA 各50 μl，然后在每孔中加入細(xì)胞懸液各100 μl，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 ～20 h 后用PBS 緩沖液洗板4 次，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)記單抗50 μl，2 ～8℃孵育1 h 后再用PBS 緩沖液洗板4 次，每孔加入顯色底物50 μl，避光室溫靜置7 min 后用蒸餾水沖洗觀察結(jié)果，用顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)孔中的斑點(diǎn)。③結(jié)果判定:陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0 ～5 個(gè)，抗原A 和抗原B 檢測孔任一孔計(jì)數(shù)－陰性孔計(jì)數(shù)≥6 判為陽性;如果陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，檢測孔斑點(diǎn)數(shù)≥2 倍陰性孔斑點(diǎn)數(shù)判為陽性。

1.3.2 A.TB 檢測:①全血刺激:每個(gè)入選病例采集3 ml 外周血標(biāo)本置于肝素鋰抗凝的試管中，立即混勻，16 h 內(nèi)進(jìn)行刺激。刺激時(shí)每個(gè)病例需取3 個(gè)無抗凝劑采血管做為反應(yīng)管，陰陽性對照管分別加入陰性刺激劑20 μl、陽性刺激劑20 μl，測試管加入刺激劑1(ESAT-6)10 μl 和刺激劑2(CFP-10)10 μl;之后每個(gè)采血管中各加入1 ml 充分混勻的全血，蓋緊蓋子劇烈晃動(dòng)直至有泡沫出現(xiàn)，然后立即直立向上置于37℃的水浴箱中孵育22 ～24 h。②制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及進(jìn)行γ-干擾素檢測:按說明配制6 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0.156 ～5 U/ml。加樣:取出試劑盒中的酶標(biāo)板，取6 種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液各100 μl 以復(fù)孔形式加入酶標(biāo)板孔中;每個(gè)樣品檢測孔中加入樣品稀釋液及待測樣品各50 μl;置37℃水浴箱中孵育1 h。用配好的洗滌液洗板5 次，拍干后每孔加入100 μl配好的檢測抗體工作液，置37℃水浴箱中孵育30 min。再用洗滌液洗板5 次，拍干后每孔加入100 μl 親和素-辣根過氧化物酶工作液，置37℃水浴箱中避光孵育30 min。用洗滌液洗板5 次后加入酶作用底物100 μl(底物A 與底物B 各50 μl 充分混勻)，37℃水浴箱中避光孵育10 min，然后每孔加入100 μl 終止液，5 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取450 nm 處的OD 值。③標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及及結(jié)果判定:應(yīng)用Microsoft office Excel 軟件，以標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度的自然對數(shù)(LN)作為橫坐標(biāo)X，OD 均值的自然對數(shù)作為縱坐標(biāo)Y，做XY 散點(diǎn)圖，添加趨勢線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=aX+b及其線性相關(guān)系數(shù)R2。分別取樣品的N(陰性對照)、T(檢測)OD 值的自然對數(shù)Y、P(陽性對照)值，然后將其代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得各自對應(yīng)的X 值，再分別求反對數(shù)后乘以稀釋倍數(shù)2，得到N、P 和T 三個(gè)濃度值，最后以P 值和T 值分別減去N 值，得到(P－N)和(T－N)值。當(dāng)N ＜0.5 U/ml 時(shí)，(TN)/(P－N)≥0.60 時(shí)判為陽性，否則為陰性;當(dāng)N≥0.5 U/ml時(shí)，(T－N)/(P－N)≥0.85 時(shí)判為陽性，否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將兩種方法測出的結(jié)果進(jìn)行比較，分析其一致性用McNemar 檢驗(yàn)，一致性強(qiáng)度采用κ 系數(shù)表示，κ ＞0.4表示兩者一致性較好，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

44 例結(jié)核病患者A.TB 檢測為陽性的有40 例，敏感性90.9%;T-SPOT.TB 檢測為陽性的有41 例，敏感性93.2%。26例非結(jié)核病患者A.TB 檢測陰性的為23 例，特異性為88.5%，T-SPOT.TB 檢測陽性的為24 例，特異性為92.3%。兩種檢測方法相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)，檢測一致性也較強(qiáng)(κ=0.819)，兩者的敏感性也較一致(P =1.000，κ=0.535)，但T-SPOT.TB 的特異性稍強(qiáng)于A.TB(P=1.000，κ=0.339)。見表1。

表1 A.TB 與T-SPOT.TB 兩試驗(yàn)方法診斷效能一致性分析

3 討論

結(jié)核病的早期快速診斷已經(jīng)成為制約結(jié)核病控制的關(guān)鍵因素。目前，常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測方法診斷陽性率不到60%。為克服傳統(tǒng)痰涂片、痰培養(yǎng)及結(jié)核菌素試驗(yàn)等檢測方法的不足，近年來發(fā)展的以T 細(xì)胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的γ-干擾素釋放試驗(yàn)，采用ELISA 或ELISPOT(酶聯(lián)免疫吸附/酶聯(lián)免疫斑點(diǎn))方法定量檢測全血/外周血單核細(xì)胞在結(jié)核菌特異性抗原刺激下釋放γ-干擾素的水平，用于診斷潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染以及結(jié)核病，比結(jié)核菌素試驗(yàn)有更高的敏感性與特異性［4］。其原理是機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌感染后產(chǎn)生的記憶性T 細(xì)胞，在再次受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激時(shí)會(huì)釋放γ 干擾素，可以在體外對釋放的γ 干擾素水平或能有效釋放γ 干擾素的T 細(xì)胞進(jìn)行定量，從而判斷機(jī)體是否結(jié)核分枝桿菌的感染者。目前有兩種較為成熟的γ-干擾素釋放分析技術(shù)，即QFT-G 試驗(yàn)(cellestis incorporated，carnegie，Australia)和T-SPOT.TB 試驗(yàn)(Oxford Immunotec，Abingdon，UK)。其對應(yīng)的方法和試劑盒先后被美國FDA 批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，CDC 為其指定了使用指南。本研究所采用的A.TB 試劑盒是以QFT-G 試驗(yàn)為基礎(chǔ)發(fā)展而來的，是利用酶聯(lián)免疫法檢測分泌的γ 干擾素的量;而T-SPOT.TB試劑盒是利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測分泌γ 干擾素的淋巴細(xì)胞數(shù)量。以往的研究中，采用的都是進(jìn)口的T-SPOT.TB 試劑盒，A.TB 試劑盒做為新研制出來的一種國產(chǎn)試劑盒，目前在國內(nèi)的應(yīng)用較少，本研究將兩種試劑盒做對比研究，發(fā)現(xiàn)其檢測效能具有較高的一致性(P ＞0.05，κ ＞0.4)，表明A.TB 試劑盒和T-SPOT.TB 試劑盒一樣，也可以作為臨床上診斷結(jié)核比較可靠的一種輔助手段。

本研究中T-SPOT.TB 試劑盒的檢測敏感性為93.2%，特異性為92.3%，這與前人的研究相符，也證實(shí)T-SPOT.TB 的確可以作為輔助檢測結(jié)核菌感染的有效手段。通過對比檢測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)A.TB 試劑盒的敏感性和特異性也很高，這可能與A.TB 采用新的方法制作刺激抗原有關(guān)。γ-干擾素釋放試驗(yàn)試劑盒中最關(guān)鍵的部分是ESAT-6 和CFP-10 抗原，目前QFT-G和T-SPOT.TB 的試劑盒主要以這兩種抗原為基礎(chǔ)［5］。ESAT-6和CFP-10 的蛋白編碼來源于結(jié)核分枝桿菌基因中的一個(gè)菌種特異性基因片斷，稱為region of difference l(RDI)。這個(gè)基因片斷不存在于大部分的非結(jié)核分枝桿菌以及所有的牛型分枝桿菌(包括卡介苗)中，因此ESAT-6 和CFP-10 作為抗原具有較高的特異性。雖然A.TB 試劑盒和T-SPOT.TB 試劑盒都采用ESAT-6 和CFP-10 作為刺激抗原，但具體的組成卻有很大的差異。A.TB 在制作刺激抗原時(shí)使用了一種新的抗原投遞系統(tǒng)作為分子注射器，用的是經(jīng)修飾的基因工程組ESAT-6 及CFP-10 全長蛋白，T-SPOT.TB 采用的刺激抗原是ESAT-6 和CFP-10 的肽段組合。全長的ESAT-6 和CFP-10 抗原可以最大限度地遞呈抗原中的影藏表位和不同免疫優(yōu)勢的表位，激活更廣泛的T 細(xì)胞進(jìn)行響應(yīng)，同時(shí)又具有抗原質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)勢。這在很大程度上提高了A.TB 試劑盒的特異性和敏感性。

除了檢測效能一致外，兩個(gè)試劑盒各有特點(diǎn)，T-SPOT.TB試劑盒在國內(nèi)的研究及應(yīng)用較多，方法成熟，結(jié)果判讀直觀，但成本較高，需提取淋巴細(xì)胞并培養(yǎng)，培養(yǎng)前操作步驟較多，較易受到污染，比較適合實(shí)驗(yàn)室條件好，醫(yī)療條件高的大型醫(yī)院;A.TB 試劑盒成本較低，用血量少，加入刺激劑后直接全血孵育，操作簡單不易污染，又節(jié)省了培養(yǎng)液，但操作過程稍復(fù)雜，需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行質(zhì)控，較適合基層醫(yī)院和大規(guī)模普查。此外T-SPOT.TB試劑盒還有用于胸腹水、肺泡灌洗液中結(jié)核桿菌感染檢測的報(bào)導(dǎo)，但A.TB 試劑盒目前還只能用于檢測全血樣本。

綜上，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的實(shí)際情況選擇其中一種方法為臨床提供及時(shí)可靠的檢測報(bào)告。

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