王鵬 王敬 李樂 霍峰 王笑茹 李春輝

近年來，舌癌的基礎和臨床研究均取得了很大發(fā)展，深入研究其發(fā)生、發(fā)展機制，全面揭示其生物學特性，對判斷其惡性程度，指導臨床治療和評估預后具有重要意義。目前有關環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，Cox-2)、β 連環(huán)蛋白(β-catenin)和凋亡抑制基因Survivin 蛋白與腫瘤的增殖、抗凋亡等關系的研究日益受到人們關注［1－3］。本研究采用RT-PCR 方法檢測舌癌組織及正常口腔黏膜中Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 及Survivin mRNA 的表達情況，旨在探討其在舌癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院口腔科2006 至2011 年手術切除及活檢后經(jīng)病理診斷明確的存檔舌癌標本60 例，其中男37 例，女23 例;年齡40 ～75 歲;所有患者手術前均未經(jīng)放療、化療或免疫治療;所有舌癌病例均經(jīng)承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科資深醫(yī)師組織病理學證實，病理診斷標準參照WHO 2002 年《頭頸部腫瘤病理學與遺傳學》，其中高分化19 例(高分化組)，中分化26 例(中分化組)，低分化15 例(低分化組)。收集舌外傷、舌修整正常舌黏膜組織30 例為正常對照。

1.2 標本處理檢測標本置－70℃液氮中保存。

1.3 主要試劑(1)總RNA 提取試劑異硫氰酸胍(Trizol Reagent):美國Invitrogen Life technologies 公司;(2)反轉錄酶(AMV);(3)RNA 酶抑制劑;(4)dNTP 混合液;(5)Oligo(dT)15;(6)γ-Taq DNA 聚合酶;(7)目的基因引物:2 ～7 均購自日本TaKaRa 公司;(8)瓊脂糖:購自美國Promaga 公司。

1.4 主要設備小型臺式離心機(SIGMA，1-13)，PCR 擴增儀(德國Biometra)，紫外分光光度計(UV-visible Spectrometer，UV300)，電泳儀(BIO-RAD，PowerPac200)，Chemi Imager 5500凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(Alphain-notech chemi Imager)。

1.5 方法

1.5.1 總RNA 的提取:TRIZOL 法提取組織總RNA，將－70℃凍存的組織取出，稱取100 mg，在EP 管中剪碎，加入TRIZOL試劑1 ml，勻漿后移入EP 管，室溫5 min 后加入0.2 ml 氯仿，振動15 s，室溫2 ～3 min。12 000 r/min 離心15 min 后將上清移入新管。每管加0.5 ml 異丙醇，室溫10 min，沉淀RNA，12 000 r/min離心10 min 后，去除上清，加1 ml 75%乙醇。漩渦振蕩后7 500 r/min 離心5 min。干燥RNA，加入DEPC 處理水20 μl。紫外分光光度計測OD260 與OD280，二者比值應1.8～2.0，提示樣本中無蛋白剩余。RNA(μg/μl)濃度=OD260×40×稀釋倍數(shù)/1 000。

1.5.2 引物合成:根據(jù)文獻及GenBank 提供RNA 序列確定引物，Cox-2 正向引物5’-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3’，反向引物5’-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTTT-3’，擴增片段長度305 bp。β-catenin 正向引物5’-TGGCCTGGTTTGATACTGACCT-3’，反 向 引 物5’-CTCTACAGGCCAATCACAATGC-3’，擴增片段長度383 bp。Survivin 正向引物5’-GATGGGTGCCCCGACGTTG-3’，反向引物5’-TCAATCCATGGCAGCCAGCT-3’，擴增片段長度430 bp。β-actin 正向引物5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’，反向引物5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’，擴增片段長度318 bp。

1.5.3 RT-PCR 反應:逆轉錄反應采用20 μl 體系。Oligo dT 1 μl，細胞總RNA 0.5 μg，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，DEPC 處理DDW 至13 μl，混合后加熱至75℃，5 min 后移至冰上使其迅速冷卻?？焖匐x心后加入5×buffer 4 pl，加熱至42℃，2 min 后加入逆轉錄酶1 μl，42℃保溫50 min 后，70℃、15 min 滅活逆轉錄酶。PCR 反應體系為25 μl(10×buffer 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，目的序列上下游引物各1 μl，cDNA2 μl，Taq 酶0.5 μl)。反應條件為95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，共30 個循環(huán);72℃延伸10 min。

1.5.4 PCR 產(chǎn)物的檢測和分析:取5 μl PCR 產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳30 ～50 min，紫外燈下照相，用凝膠成像處理系統(tǒng)對每一樣品PCR 產(chǎn)物擴增的特異性片段進行掃描，以β-actin 密度作為參考定量標準，目的基因Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 和Survivin mRNA 的表達量分別以Cox-2、β-catenin 和Survivin 與β-actin 密度之比表示。

1.6 統(tǒng)計學分析應用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析，相關性用Pearson 相關分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 和Survivin mRNA 的表達情況在305 bp 處可見有Cox-2 條帶，382 bp 處可見β-catenin 條帶，430 bp 處可見Survivin 條帶。60 例舌癌中Cox-2、Survivin的表達明顯增高，而在30 例正常黏膜中未見表達;β-catenin 在正常黏膜和舌癌中均見表達，但表達強度顯著不同。見圖1 ～3。

圖1 Cox-2 mRNA 在各組中的表達

圖2 β-catenin mRNA 在各組中的表達

圖3 Survivin mRNA 在各組中的表達

2.2 不同分化程度舌癌中Cox-2、β-catenin、Survivin mRNA 的表達Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA、Survivin mRNA 表達隨分化程度的降低而升高，低分化組Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA、Survivin mRNA 表達顯著高于高、中分化組(P ＜0.05)。見表1。

表1 不同分化程度舌癌中Cox-2、β-catenin、Survivin mRNA 的表達±s

表1 不同分化程度舌癌中Cox-2、β-catenin、Survivin mRNA 的表達±s

注:與低分化組比較，*P ＜0.05

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2.3 Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 與Survivin mRNA 的表達的相關分析Cox-2 mRNA 與β-catenin mRNA 的表達呈正相關(r=0.856，P ＜0.01);Cox-2 mRNA 與survivin mRNA 的表達呈正相關(r=0.985，P ＜0.01);β-catenin mRNA 與Survivin mRNA 的表達呈正相關(r=0.857，P ＜0.01)。

3 討論

Cox-2 是一種催化致炎性物質地諾前列酮合成的重要限速酶，在體內(nèi)呈誘導性表達，在生理狀態(tài)下多數(shù)組織不表達Cox-2。當受到炎性細胞因子、生長因子和內(nèi)毒素以及某些有絲分裂原的刺激時，Cox-2 的表達水平增強。Cox-2 過度表達可導致地諾前列酮的合成增加，進而促進許多腫瘤的形成。Iniesta等［4］提出通過檢測患者血清中Cox-2 的表達對非小細胞癌進行診斷、分期及對預后的評估，既有效又簡便。在本實驗中，經(jīng)過對舌癌組織及正常黏膜組織中Cox-2 的表達水平進行測定發(fā)現(xiàn):在正常組織中未見表達，Cox-2 在舌癌中的表達明顯增強。實驗結果顯示，Cox-2 陽性表達與舌癌組織的分化程度呈負相關，低分化舌癌與高中分化舌癌差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。舌癌組織中Cox-2 高表達，可能與其誘導細胞增殖、抑制凋亡、增強腫瘤的侵襲性及轉移活性，促進VEGF 生成從而促進腫瘤血管的形成有關［5，6］。這提示Cox-2 可能會是一個有價值的指標用以判斷舌癌進展的惡性程度。

β-catenin 是一種由連環(huán)蛋白基因(CTNNB1)編碼的多功能蛋白質。β-catenin 的表達變異會關系到腫瘤中骨架蛋白及調(diào)控作用的改變，從而加速腫瘤的惡性轉變［7］。Fuchs 等［8］的實驗研究中顯示β-catenin 可通過形成特定復合物，參與口腔鱗狀細胞癌的生物學行為過程。Yasusei 等［9］對一個口腔鱗狀細胞癌細胞系的淋巴結轉移灶進行了分析研究，結果表明，母細胞的侵襲能力顯著低于無性繁殖系。本實驗通過應用RT-PCR技術，檢測了β-catenin 在舌癌組織及正常黏膜組織中的表達，結果表明，在正常組織及舌癌組織中β-catenin 均有表達，但表達強度有明顯差異;比較分析高中分化舌癌與低分化舌癌間的關系，發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。這表明，β-catenin可能作為舌癌的一個重要預后因子用于舌癌的惡性程度的判斷及指導臨床治療工作;β-catenin 還可能是舌癌進展的重要調(diào)控因子，其機制可能與腫瘤細胞中的Wnt 信號通路異常和細胞失去黏附功能導致細胞分散，癌細胞表型改變獲得高侵襲性有關［10］。

Survivin 是IAP(凋亡抑制蛋白)家族的最新成員，位于染色體17q25，全長15kb。Marusawa 等［11］認為Survivin 通過抑制Caspases-9 的活性來誘導細胞凋亡，而不是Caspases-3 和Caspases-7。Lo Muzio 等［12］的實驗研究表明Survivin 在口腔癌病變向侵襲性癌的轉變過程中，具有重要評估意義。本實驗通過RT-PCR 技術檢測Survivin 在舌癌及正常黏膜中的表達，結果發(fā)現(xiàn):Survivin 在正常黏膜中未見表達，而在舌癌中高表達，且與組織分化程度有一定關系，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)呈負相關;這提示Survivin 可能是舌癌的一個重要調(diào)控指標。Survivin 與其他腫瘤指標之間是如何相互作用和聯(lián)系的，我們?nèi)孕枰M一步研究。

舌癌的發(fā)生發(fā)展是由多個基因參與、多種因素共同作用的結果。進展過程中Cox-2、β-catenin 和Survivin 基因之間存在密切關系，它們在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能相互影響。Cox-2 與βcatenin 的表達相互促進，Cox-2/β-catenin 通路上調(diào)Survivin 的表達，Survivin 又促進癌細胞的增殖。它們之間可能存在特殊的調(diào)控關系，其具體作用機制有待于我們進一步探討。

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3 Stenner M，Demgensky A，Molls C，et al.Prognostic value of survivin expression in parotid gland cancer in consideration of different histological subtypes.European Journal of Cancer，2011，47:1013-1020.

4 Iniesta P，Moran A，De Juan C，et al.Biological and clinical siguificance of MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TIMP-2 in non-small cell lung cancer.Oncol Rep，2007，17:217-223.

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7 Brabletz T，Hlubek F，Spaderna S，et al.Invasion and metastasis in colorectal cancer:epithelial-mesenchymal transition，mesenchymal-epithelial transition，stem cells and beta-catenin.Cells Tissues Organs，2005，179:56.

8 Fuchs SY，Ougolkov AV，Spiegelman VS，et al.Oncogenic beta-Catenin Signaling Networks in Colorectal Cancer.Cell Cycle，2005，4:1522-1539.

9 Yasusei K，Shojiro K，Ikuko O，et al.Invasion and metastasis of oral cancer cells require methylation of E-cadherin and/or degradation of membranous β-catenin.Clin.Cancer Res，2004，6:5455.

10 張衛(wèi)民，高巖.Wnt 信號傳導通路組成蛋白與口腔鱗狀細胞癌的分化和增殖.中華口腔醫(yī)學雜志，2005，40:491.

11 Marusawa H，Matsuzawa S，Welsh K，et al.HBXIP functions as a co-factor of survivin in apoptosis supperssion.EMBO，2003，22:2729-3740.

12 Lo Muzio L，Pannone G，Leonardi R，et al.Survivin，a potential early predictor of tumor progression in the oral mucosa.J Dent Res，2006，82:923-928.