潘國強 齊鳳平 王相利

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是存在于骨髓中非造血干細(xì)胞的另一種具有多分化潛能的干細(xì)胞。因具有強大的增殖能力和多向分化潛能，MSCs成為現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。2000年 Woodbury等［1］首次將MSCs在體外誘導(dǎo)分化為外胚層起源的神經(jīng)元樣細(xì)胞。隨后，國內(nèi)外均有實驗證明了這一點，這為臨床神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療開啟了一片光明［2］。但對于MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的確切機制目前還不清楚。金雀異黃素(Genistein)是一種異黃酮類的植物雌激素，在蠶豆中廣泛分布，具有弱雌激素的生物活性，是一種特異性的酪氨酸蛋白激酶抑制劑，Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使參與許多生命活動過程，如細(xì)胞代謝、增殖等。為探討使用金雀異黃素阻斷酪氨酸激酶能否對細(xì)胞內(nèi)Ca2+有影響及金雀異黃素對MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞過程中細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白有無變化，本試驗進一步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機制。報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 培養(yǎng)細(xì)胞、免疫組化和激光掃描共聚焦顯微鏡實驗在華北煤炭醫(yī)學(xué)院中心實驗室完成。實驗用材料:L-DMEM培養(yǎng)基(Sigma)、胎牛血清 FBS(Hyclone)、Percoll分離液(Sigma)、胰蛋白酶(Amersco)、DEPC(Amersco)、Trizol(invitrogen)、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．2 方法

1．2．1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng):取健康成年SD大鼠(雄性，150～200 g，清潔級，由中國藥物檢定所動物中心提供)，無菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨，用含10%FBS的LDMEM，反復(fù)沖洗骨髓腔，沖出骨髓后充分混勻，離心后棄上清及脂肪層，沉淀用L-DMEM培養(yǎng)基混勻，輕輕疊加到密度為1．073 g/ml的Percoll分離液上，離心后取乳白色單核細(xì)胞層(中間界面層)，再用L-DMEM混勻離心洗滌兩次，細(xì)胞沉淀中加入 L-DMEM(含10%FBS)，記數(shù)細(xì)胞，調(diào)整密度，按1×109密度接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中，置于CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，棄掉未貼壁細(xì)胞。以后每3天換1次液。待培養(yǎng)的細(xì)胞增殖接近融合狀態(tài)時，用0．25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察不同時期細(xì)胞生長情況。

1．2．2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化:細(xì)胞傳至第5代，待細(xì)胞融匯成致密單層后，去除培養(yǎng)液，以0．01 mol/L PBS(pH值7．4)沖洗3 次，加入預(yù)誘導(dǎo)液(L-DMEM、1 mmol/Lβ-巰基乙醇、20%FBS)，進行預(yù)誘導(dǎo)，24 h后去除預(yù)誘導(dǎo)液，0．01 mol/L PBS沖洗3次，加入誘導(dǎo)液(L-DMEM、5 mmol/L β-巰基乙醇)，誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，并在倒置相差顯微鏡下進行觀察、照相。

1．2．3 免疫組化技術(shù)檢測:將18 mm×20 mm的蓋玻片放在6孔板中，待細(xì)胞融匯成致密單層后，去除培養(yǎng)液，同步化24 h，加入濃度分別為0、25、50、75和 100 μmol/L 的金雀異黃素(誘導(dǎo)前后各10個樣本)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，PBS洗2次，按照Woodbury經(jīng)典誘導(dǎo)方案進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)前后細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，按SABC法檢測生長相關(guān)蛋白-43(Growth Associated Protein，GAP-43)、神經(jīng)元烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、神經(jīng)絲(neurofilament，NF)和巢蛋白(Nestin)誘導(dǎo)前后的蛋白表達(dá)。光鏡下觀察，以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，未著色為陰性。選擇5～10個高倍鏡視野，采用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)隨機計數(shù)200個細(xì)胞，陽性細(xì)胞率=(陽性細(xì)胞數(shù)/200)×100%。

1．2．4 激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測:細(xì)胞傳至第四代，細(xì)胞消化后傳至共聚焦專用培養(yǎng)皿中(誘導(dǎo)前后各6個樣本)，待細(xì)胞融匯成致密單層后，去除培養(yǎng)液，同步化24 h，加入濃度分別為 0、25、50、75 和100 μmol/L 的金雀異黃素，37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，用含有1 mmol/L的β-巰基乙醇，20%胎牛血清的 L-DMEM進行預(yù)誘導(dǎo)，24h后去除預(yù)誘導(dǎo)液，0．01 mol/LPBS(pH 值 7．4)沖洗 3 次，加入含有 10 μmol/L Fluo-3/AM的L-DMEM培養(yǎng)液負(fù)載45 min，每隔10 min輕輕吹打，避光，45 min 后，0．01 mol PBS(pH 值 7．4)沖洗 3 次，加入誘導(dǎo)液(L-DMEM、5 mmol/L β-巰基乙醇)進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行觀測細(xì)胞形態(tài)和熒光強度的變化。利用分析軟件對數(shù)據(jù)化圖像進行分析，以參數(shù)平均灰度代表細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化。

1．3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11．5統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 MSCs培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化 加入預(yù)誘導(dǎo)液24 h后MSCs細(xì)胞體積縮小，立體感增強，細(xì)胞邊緣變得不規(guī)整，部分細(xì)胞有細(xì)的指狀突起，其中約2%的MSCs胞體已變成近似球形，具有短的突起，形狀類似神經(jīng)元。在加入誘導(dǎo)液后約10 min，觀察到細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化，胞體回縮，變得致密有折光性，向外伸出突起。約30 min后，部分細(xì)胞向具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)特點的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，扁平的胞漿向胞核進一步收縮，細(xì)胞體逐漸變成圓形或錐形，折光性增強，胞體周圍具有較強的光暈，胞體伸展的突起繼續(xù)延長。以后隨時間進展，1 h、5 h具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)特點的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成雙極或多極細(xì)胞，而且細(xì)胞的多個突起發(fā)出分支，相互交織成網(wǎng)。到5 h后MSCs轉(zhuǎn)化達(dá)到峰值，形態(tài)也不再發(fā)生明顯改變，具有典型的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)。

2．2 免疫組化結(jié)果 0、25、50、75 和 100 μmol/L 的金雀異黃素培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24 h及誘導(dǎo)后，隨著金雀異黃素濃度的增加，GAP-43、NSE、NF和Nestin的陽性細(xì)胞率即蛋白水平逐漸增加，25、50、75 和 100 μmol/L 的金雀異黃素 4組與0 μmol/L的金雀異黃素組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。見圖 1、2，表 1。

圖1 0 μmol/L金雀異黃素誘導(dǎo)前MSCs NSE陽性細(xì)胞(SP×100)

圖2 0 μmol/L金雀異黃素誘導(dǎo)后MSCsNSE陽性細(xì)胞(SP×100)

表1 不同濃度金雀異黃素作用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞前后免疫組化結(jié)果

2．3 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果 MSCs負(fù)載熒光探針Fluo-3/AM 45 min后，固定放置在激光掃描共聚焦顯微鏡37℃載物臺上，0．01 mol PBS(pH 值7．4)洗3次，加入誘導(dǎo)液(L-DMEM、5 mmol/L β-巰基乙醇)無血清培養(yǎng)液。從加誘導(dǎo)劑時開始在488 nm激光下掃描觀測細(xì)胞形態(tài)和熒光強度的變化。利用分析軟件對數(shù)據(jù)化圖像進行分析，以參數(shù)平均灰度代表細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化。更換誘導(dǎo)液后，各組細(xì)胞內(nèi)熒光強度逐漸增加，到100 s達(dá)高峰值，其后逐漸減弱，但20 min時細(xì)胞熒光強度仍高于誘導(dǎo)前，此時可見MSCs開始向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，但是隨著金雀異黃素濃度的增加，［Ca2+］i濃度增加的幅度明顯降低(P ＜0．05)。見圖3～5。

圖3 0 μmol/L金雀異黃素誘導(dǎo)前MSCs細(xì)胞熒光圖象(SP×200)

圖4 0μmol/L金雀異黃素誘導(dǎo)后MSCs細(xì)胞熒光圖象(SP×200)

圖5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞熒光強度的變化

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，胎兒臍血中亦可分離得到。MSCs易于貼附于塑料培養(yǎng)板表面，有自我更新和增殖的能力，具有多向和橫向分化的能力，可分化為3個胚層來源的多種組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和肝卵圓細(xì)胞等。MSCs取材方便，易于培養(yǎng)，遺傳背景穩(wěn)定，自體移植無明顯免疫排斥反應(yīng)，不涉及倫理道德等問題，并且易于被外源基因轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)，因而被認(rèn)為是組織工程理想的種子細(xì)胞。應(yīng)用β-巰基乙醇(beta-mercaptoethanol，BME)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和4-羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)等作為誘導(dǎo)劑，在體外成功地誘導(dǎo)成年大鼠和人的MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，這為臨床神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療開啟了一片光明［3，4］。

金雀異黃素(Genistein)是一種異黃酮類植物雌激素，在蠶豆中廣泛分布，具有弱雌激素的生物活性，是一種特異性酪氨酸蛋白激酶抑制劑［5］。在本次試驗中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按照Woodbury方案進行誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞后，通過免疫組化證實GAP-43、NSE、NF、Nestin蛋白水平明顯增加，并具有典型的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)。隨著金雀異黃素濃度增加，誘導(dǎo)后GAP-43、NSE、NF、Nestin蛋白水平亦明顯增加，說明金雀異黃素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞可能有促進作用。

鈣離子幾乎調(diào)控機體所有的生理活動，細(xì)胞受刺激后，通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞內(nèi)鈣池Ca2+釋放和細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，二者都引起胞漿［Ca2+］i升高，其中細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流是引起細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i持續(xù)升高的關(guān)鍵因素。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)信使發(fā)揮作用，其絕對濃度并不是很重要，而其時-空特性在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用越來越受到重視［6］。

激光共聚焦掃描顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)是將光學(xué)顯微鏡技術(shù)、激光掃描技術(shù)和計算機圖像處理技術(shù)結(jié)合在一起的一種高尖設(shè)備，這一技術(shù)也稱之為“細(xì)胞斷層掃描”即細(xì)胞CT［7］。Fluo-3/AM是Fluo-3的酯化形式，可透過細(xì)胞膜進入細(xì)胞，其已酰羥甲基酯(AM)形式無熒光，游離態(tài)也無熒光，F(xiàn)luo-3/AM在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解成Fluo-3，F(xiàn)luo-3與游離鈣結(jié)合后熒光增強50～100倍，為所有鈣熒光探針中變化最大者。Fluo-3產(chǎn)生的熒光強度與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度成正比，熒光強度的變化可指示游離鈣離子的相應(yīng)變化。Fluo-3可用488 nm氬激光激發(fā)，適用于激光掃描共聚焦顯微鏡。pH值為7．0以上時對其不敏感，對Mg2+也不敏感，故測量結(jié)果不宜受這些因素的干擾，故此fluo-3/AM是最佳的用于激光光源的熒光染料。

在本次實驗中，各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按照Woodbury經(jīng)典誘導(dǎo)方案進行誘導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)熒光強度逐漸增加，到100 s達(dá)高峰值，其后逐漸減弱，但20 min時細(xì)胞熒光強度仍高于誘導(dǎo)前，此時可見MSCs開始向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，但隨著金雀異黃素濃度的增加，Ca2+i濃度各組同時間增加的幅度明顯降低。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要第二信使，在Woodbury經(jīng)典誘導(dǎo)過程中可能不起關(guān)鍵性作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按照Woodbury方案進行誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞是否可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一系列反應(yīng)，啟動MSCs的神經(jīng)元發(fā)育和分化基因表達(dá)，以及MSCs的細(xì)胞骨架(微絲、微管和中間絲)重排，導(dǎo)致細(xì)胞伸出細(xì)長突起，部分相鄰的細(xì)胞突起連接成網(wǎng)狀，表達(dá)神經(jīng)元特異標(biāo)志物如GAP-43、NSE、NF、Nestin等，從而MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，具體機制有待進一步研究。

1 Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al．Adult rat and human marrow stromal cells differentiate into neurons．J Neurosci Res，2000，61:364-370．

2 Novikova LN，Brohlin M，Kingham PJ，et al．Neuroprotective and growthpromoting effects of bone marrow stromalcells after cervical spinal cord injury in adult rats．Cytotherapy，2011，13:873-887．

3 Schwarz SC，Schwarz J．Translation of stem cell therapy for neurological diseases．Transl Res，2010，156:155-160．

4 Matsuse D，Kitada M，Kohama M，et al．Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells differentiate into functional Schwann cells that sustain peripheral nerve regeneration．J Neuropathol Exp Neurol，2010，69:973-985．

5 Ma HP，Ming LG，Ge BF，et al．Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast differentiation and mineralization in vitro．J Cell Biochem，2011，112:916-923．

6 Fischer W，Nrenberg W，F(xiàn)ranke H，et al．Increase of intracellular Ca2+by P2Y but not P2X receptors in cultured cortical multipolar neurons of the rat．J Comp Neurol，2009，516:343-359．

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