高 昊， 劉利平， 馬 鑫， 陳 蘊， 金 堅

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

BNP作為心臟分泌的利尿鈉肽家族的一員，起初是從豬腦中被提取純化的[1]。內(nèi)源性人BNP是一種主要由心室肌分泌的循環(huán)多肽，其分泌水平與心室內(nèi)容量和壓力負荷狀態(tài)相關[2]。心臟在功能受損時分泌BNP，起到對抗性調(diào)節(jié)激素作用，即通過與RAAS內(nèi)皮質(zhì)素-1和SNS等生理性拮抗和抑制作用來維持心功能與體液平衡[3]。隨著心臟功能的進一步惡化，血管神經(jīng)激素系統(tǒng)和保鈉潴水激素系統(tǒng)的過度激活，機體陷入循環(huán)系統(tǒng)病理生理紊亂，最終掩蓋了內(nèi)源性BNP心臟保護的代償作用[4]。適時給予外源性BNP，使其血漿濃度增加2～6倍，可迅速改善急性失代償患者血流動力學、神經(jīng)激素水平和臨床體征，降低患者的死亡率[5]。

重組人腦鈉肽 （recombinant human brain natriuretic peptide，rhBNP）注射液已先后被美國FDA和中國SFDA批準上市，用于急性失代償性心衰的治療，其臨床治療方式為靜注，療程在2周以上。經(jīng)過10余年的臨床應用，The Connor Group等機構通過歐美多個醫(yī)學中心的6 000多個治療病例，分析發(fā)現(xiàn)FDA批準上市的奈西立肽（重組人腦鈉肽商品名）治療心衰患者后，其死亡率和再住院率沒有明顯的改善，卻與患者中低血壓病例的數(shù)量增長有直接的聯(lián)系，因此Connor等機構不推薦奈西立肽作為心衰病人的一線治療藥物[6]。在國內(nèi)，作者在與一些心血管醫(yī)師的溝通中也獲得該類藥物存在療效不穩(wěn)定的缺陷。從FDA公布的資料來看，BNP類藥物是一類有效的血管擴張劑，但利尿作用不明顯，且成藥性研究也與臨床應用結果差距頗大。作者推測其問題可能主要存在兩個方面：第一，rhBNP因原核表達除了產(chǎn)物完整性的因素外，缺乏對其有效二級結構進行必要的構象限定；第二，生產(chǎn)廠家在制劑制備過程中未對rhBNP進行系統(tǒng)的微環(huán)境研究，導致高活性rhBNP的二級結構不穩(wěn)定。作者以化學合成獲得的完整BNP為研究對象，通過設計不同的緩沖體系來提高和穩(wěn)定BNP的活性，為開展更有效的BNP注射劑配方研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

BNP （氨基酸序列：SPKMVQGSGCFGRKMDRI SSSSGLGCKVLRRH），由上海生工生物工程有限公司合成，純度＞99%，未對其第10位和26位的Cys進行氧化形成鏈內(nèi)二硫鍵。新活素（凍干重組人腦利鈉肽），為成都諾迪康生物制藥有限公司產(chǎn)品（國藥準字S20050033），其注射劑組成為0.5 mg重組人腦利鈉肽、8 mg 甘露醇、1.73 mg Na2HPO4、0.93 mg NaH2PO4、9 mg NaCl。去氧腎上腺素，系阿拉丁產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自于國藥集團化學試劑有限公司。

Krebs溶液的配制：NaCl 9.0 g、 KCl 0.42 g、CaCL20.24 g、NaHCO30.1～0.3 g、 葡萄糖 1.0～2.5 g（1 000 mL），葡萄糖在使用前加入。

新西蘭家兔，體質(zhì)量2～2.5 kg，雌雄不限，由江蘇省血吸蟲防治研究所實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 離體血管的灌流實驗 家兔耳緣靜脈空氣推注處死后，取其胸主動脈，在預冷的氧飽和Krebs液中分離結締組織，制成系列3～4 mm長的血管片段，每個實驗所用的血管條數(shù)均為6。將兔胸主動脈血管片段于37℃通氧條件下懸吊入含4 mL Krebs溶液的平滑肌浴漕中，接張力換能器到生物機能實驗系統(tǒng)（改良型血管、胃腸和子宮等離體灌流實驗系統(tǒng)，medease改良型，南京美易科技有限公司），記錄血管張力的變化。初始張力定位2.5 g，經(jīng)6 μmol/L KCl溶液灌洗和去KCl溶液平衡20 min后，給予6 μmol/L的去氧腎上腺素作為預刺激。待收縮張力穩(wěn)定后，再給予10-8～10-5mol/L BNP觀察血管片段張力變化。以新活素的純水溶液作為陽性對照，逐步增加以制成累計濃度—舒張反應曲線，待藥物濃度達到10-5mol/L時，停止加藥并記錄舒張反應。詳見文獻[7]。

1.2.2 pH梯度緩沖液的配備 考察pH分別為4、5、6、7、8（偏差±0.2），緩沖液體系分別為醋酸/醋酸鈉（醋酸鹽）、磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀（磷酸鹽）和檸檬酸/磷酸氫二鈉 （檸檬酸鹽）3種體系下BNP的活性表現(xiàn)。按表1所列濃度配置母液，然后按表2的比例制備緩沖液。各緩沖液的pH均在其緩沖范圍內(nèi)[8]，如表 3所列。

1.2.3 斑馬魚體內(nèi)試驗 取數(shù)尾斑馬魚幼魚置于六孔板中，加入3 mL魚水，再加入的特非那定溶液至一定濃度，誘導一定時間后，移除誘導劑，用魚水清洗3次，在顯微鏡下挑選靜脈淤血明顯的斑馬魚進行注射。用微量加樣槍頭吸取3 μL待測藥液，推注入顯微注射針中，將針裝入注射柄中，調(diào)節(jié)壓力和注射時間使注射量為10 nL。隨后將挑選的斑馬魚幼魚置于含160 μg/mL的MS222（間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，魚用麻醉藥）的魚水中，麻醉至無觸碰反應后，對其進行靜脈注射，注射結束后用正常魚水進行清洗，直至復蘇，放置28℃培養(yǎng)箱進行孵育。在給藥后2 h，針對斑馬魚的心臟及靜脈淤血部位進行照相，觀察淤血有無消除。

表1 母液的制備Table 1 Preparation of mother solution

表2 緩沖液的制備Table 2 Preparation of buffer

表3 緩沖容量Table 3 Buffer capacity mol/L

2 結果與討論

2.1 重組BNP醋酸/醋酸鈉緩沖溶液對離體血管的影響

將藥物對數(shù)濃度和舒張率的數(shù)據(jù)收集并繪制累計濃度—舒張反應曲線，計算各個pH條件下BNP的EC50和95%可信區(qū)間，并與陽性藥物做統(tǒng)計分析。如圖1和表4所示，BNP在pH為4和5的醋酸/醋酸鈉條件下，均對血管具有顯著的舒張效應，且在pH=5醋酸/醋酸鈉緩沖液條件下，BNP舒張兔胸主動脈血管片段作用的最適濃度為10-7mol/L。而pH=6的BNP緩沖溶液與陽性對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。在實驗觀察的干預藥物濃度內(nèi)均優(yōu)于pH=6的溶液條件，暗示接近生理pH的醋酸溶液對BNP活性保持有利。EC50的提高，則說明酸性條件下有利于穩(wěn)定BNP的活性。

圖1 BNP的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液與家兔離體血管舒張效應的劑量關系Fig.1 Relationship between BNP in HAc/NaAc buffer concentration and relaxation effects on isolated vascular

表4 醋酸/醋酸鈉緩沖液的EC50及其95%可信區(qū)間Table 4 EC50 and 95%Confidence Intervals of 醋 酸/醋酸鈉buffer

2.2 重組BNP磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖溶液對離體血管的影響

從圖2和表5可知，在pH為6和7的磷酸鹽緩沖條件下，BNP均能明顯表現(xiàn)出舒張兔胸主動脈血管環(huán)的作用；而當pH=8時，BNP則失去活性。與pH=6時的舒張血管效果不同，pH=7時舒張血管沒有劑量依賴關系，但作用濃度范圍明顯加寬，效果穩(wěn)定性提高。與圖1中的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液相比較，BNP在近中性的生理條件下能保持較高的生物活性是磷酸鹽緩沖條件的顯著優(yōu)勢。

圖2 BNP的磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀緩沖溶液與家兔離體血管舒張效應的劑量關系Fig.2 Relationship between BNP in K2HPO4/KH2PO4 buffer concentration and relaxation effects oon isolated vascular

表5 磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀緩沖液的EC50及其95%可信區(qū)間Table 5 EC50 and 95%Confidence Intervals of K2HPO4/KH2PO4buffer

2.3 重組BNP檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液對離體血管的影響

由圖3和表6分析得知，BNP在檸檬酸緩沖條件下活性與劑量依賴關系更明確。當pH為4～6時，實驗高濃度BNP的檸檬酸緩沖溶液對兔胸主動脈血管片段不僅表現(xiàn)出了更好的舒張效果 （50%vs 100%，50%vs 100%）， 而且在 10-8～10-5mol/L 濃度區(qū)間內(nèi)呈良好的劑量依賴性，因而BNP在這個條件下會有更佳的安全性和更高的活性。

圖3 BNP的Citric acid/Na2HPO4緩沖溶液與家兔離體血管舒張效應的劑量關系Fig.3 Relationship between BNP in Citric acid/Na2HPO4 buffer concentration and relaxation effectson isolated vascular

表6 檸檬酸/磷酸二氫鉀緩沖液的EC50及其95%可信區(qū)間Table 6 EC50 and 95%Confidence Intervals of Citric acid/Na2HPO4buffer

2.4 斑馬魚體內(nèi)試驗

雖然離體血管灌流實驗能夠有效地觀察到BNP在不同緩沖溶液中的活性，但是體外試驗的局限性并不能夠了解BNP對于心臟的作用，因此隨后委托杭州環(huán)特生物有限公司在斑馬魚上做體內(nèi)試驗來評價BNP在不同緩沖體系的體內(nèi)活性。

2.4.1 給藥前處理 挑選生長發(fā)育完整的斑馬魚成體，使用特非那定在斑馬魚模型上制造心衰淤血模型，如圖4所示斑馬魚給藥后患有心包水腫，同時伴有淤血。

圖4 斑馬魚模型Fig.4 Zebra fish model

2.4.2 給藥注射觀察 分別給斑馬魚心衰模型注射空白緩沖液和BNP緩沖液，pH值分別為4和5，注射后的心臟形態(tài)如圖5和圖6。根據(jù)圖5和圖6能夠發(fā)現(xiàn)：BNP在pH=4和pH=5的檸檬酸緩沖液體系中對心臟具有良好的活性和療效。兩者都有效地改善了斑馬魚的心包水腫癥狀并消除了顯著淤血。并且BNP在pH=4的條件下其消除淤血的能力比pH=5的條件下要強，而這也與家兔離體血管實驗中對于血管舒張的結果相吻合。

圖5 pH=4.0的BNP緩沖液對模型的影響Fig.5 Effect of BNP in pH=4.0 buffer in zebra fish model

圖6 pH=5.0的BNP緩沖液對模型的影響Fig.6 Effect of BNP in pH=5.0 buffer in zebra fish model

2.5 討論

BNP等多肽藥物的共性需要有效二級結構的構象限定才能保持活性[9]，本實驗中雖然不同緩沖條件的BNP溶液在離體兔胸主動脈血管片段上都表現(xiàn)出了一定的舒張作用，但差異性很大，更加值得重視的是在實驗設計的條件下，對照藥物都未獲得有效的結果，也進一步證明微環(huán)境研究對不穩(wěn)定的多肽藥物二級結構的重要性。實驗結果顯示，偏酸的多數(shù)緩沖條件均利于BNP活性的保持，偏堿則反之。在微偏酸的醋酸/醋酸鈉緩沖液條件下，BNP活性保持的效果明顯，表現(xiàn)為有效濃度下降，但活性保持與劑量關系復雜，高劑量頻繁出現(xiàn)舒張不應、反而收縮的表象降低了該緩沖體系的適用性。

已上市的BNP藥物采用的磷酸鹽緩沖條件，在近中性的生理條件下可保持較高的BNP生物活性，這是其作為制劑緩沖條件的優(yōu)勢。雖然BNP的作用穩(wěn)定性在磷酸鹽緩沖條件下得以明顯提高，但舒張血管作用的非劑量依賴關系，對于外源給予BNP改善急性失代償性心衰的癥狀不利，是否是Connor等機構觀察發(fā)現(xiàn)rhBNP對治療指數(shù)無效性的原因之一，尚需進一步補充證明。與對照藥物相比，BNP在微偏酸的檸檬酸溶液中的離體兔胸主動脈血管片段舒張率提高了4倍（100%vs 20%），且呈現(xiàn)了良好的藥物劑量依賴效應，因此檸檬酸緩沖液作為BNP注射劑的基質(zhì)是確實可行的。急性失代償性心衰癥狀緩解的治療關鍵是 “強心、擴血管和利尿”[10]，明確檸檬酸緩沖條件下BNP舒張血管的劑量依賴關系，對于臨床治療制劑的設計有利，pH 5或6的檸檬酸緩沖液具有作為改進BNP注射劑處方的潛在價值。

3 結語

在相同的緩沖體系條件下，BNP的活性隨pH值而變化，其在酸性環(huán)境下的活性明顯好于中性和堿性條件下的活性，推測這是因為BNP在酸性條件下的結構特征能夠更好地與血管上的作用受體相結合。雖然在酸性環(huán)境下BNP都表現(xiàn)出了活性，但在同一pH條件下，不同緩沖體系間的活性差異也極其顯著，它表明BNP在特定緩沖體系條件下所形成的構象對于其受體也具有更高的活性。這也意味著一些看似結構簡單的多肽類藥物也與大分子蛋白質(zhì)相類似，必須有著正確的折疊結構才會表現(xiàn)出更高的活性和穩(wěn)定性，而這卻是以往實驗中常常被忽略的現(xiàn)象。同時也意味著在多肽類藥物的生產(chǎn)過程中，重組表達方法并不能生產(chǎn)出合格的多肽類藥物產(chǎn)品，其外在環(huán)境對多肽活性的影響也是需要考慮的，還提示化學合成的多肽原料藥需要進行優(yōu)化折疊和折疊后構象限定的工藝研究。

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