王毅錚，高雅婷，胡 杰，高宏生，陳 虹

植物雌激素(phytoestrogen，PE)是指一類非甾族植物來源的具有雌激素活性的化合物，其通過與甾體雌激素受體以低親和度結(jié)合而發(fā)揮弱的雌激素樣效應［1］。體外實驗證實，植物雌激素是一類生物活性較弱的雌激素［2］，具有雌激素激動劑和阻斷劑效應，對于與雌激素相關的疾病有較好的防治效果［3-6］。

白藜蘆醇(resveratrol，RES)又名3，5，4＇-三羥基二苯乙烯，是一種結(jié)構類似雌激素已烯雌酚(Diethy1-stilbestrol，DES)的天然多酚類化合物，其雌激素樣作用目前倍受關注。Madsen［6］研究表明，植物雌激素與雌二醇(E2)競爭結(jié)合雌激素受體(ER)。E2的信號傳導是由ER 介導的，而植物雌激素與ER 的作用方式是否與雌激素一致，尚無確切參考依據(jù)。本研究以白藜蘆醇為對象，通過研究它對ER 及其所介導的細胞信號傳導通路的影響，以討論植物雌激素的作用機制，為防治更年期綜合征等一系列激素缺乏性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與試劑 人乳腺癌細胞MCF-7(ERα+/ERβ+)由武警后勤學院免疫教研室提供。白藜蘆醇(純度＞95%)購于中國藥品生物制品檢定所，MTT、DMSO為美國Sigma 公司產(chǎn)品，RMPI1640、無酚紅RMPI1640、胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品，活性碳-葡聚糖處理的胎牛血清(CDTFBS)為美國Hyclone 公司產(chǎn)品，抗體及二抗試劑盒購于北京中杉生物技術有限公司。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞接種于含10%胎牛血清，100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每1～2 d 換培養(yǎng)液1次。當細胞生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代。細胞于加藥前2 d 換用無酚紅RPMI1640 培養(yǎng)液(內(nèi)含5%CDT-FBS)繼續(xù)培養(yǎng)，以耗盡細胞內(nèi)儲存的雌激素。

1.2.2 MTT 實驗 設溶劑對照組、正常MCF-7細胞組、ERα+ERβ--MCF-7(ERα+組)和ERα-ERβ+-MCF-7(ERβ+組)細胞組。取各組對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μl(約含1000個細胞)，置37℃，5% CO2溫箱中培養(yǎng)。次日，MCF-7、ERα+和ERβ+各組細胞中加入終濃度為0.1 μmol/L 的白藜蘆醇(依據(jù)前期實驗測得0.1 μmol/L 白藜蘆醇對MCF-7 細胞有較強的增殖活性［7］)，每組至少設3個平行孔。溶劑對照組加入與給藥組等體積的溶劑，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于加藥后0～6 d 每天取一個96 孔板，棄培養(yǎng)液，每孔加50 μl濃度為1 mg/ml 的MTT 溶液(未加血清的無酚紅RPMI1640 培養(yǎng)液配制)。37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μl 溶解甲簪顆粒，輕度振蕩使之溶解。用酶標儀，在檢測波長490 nm 條件下測定光密度值(OD)，以溶劑對照處理的細胞為對照組，用下面公式計算藥物對細胞的增殖率:增殖率(%)=(給藥組平均OD值-對照組平均OD值)/(對照組平均OD值)×100%。每一實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術檢測 取各組細胞1 ×106個，離心后去上清，PBS 洗滌一次。將細胞懸起，每管加70%冷乙醇約2 ml 固定，4°C 過夜。次日1000 r/min 離心5 min，去乙醇，PBS 洗滌2次，1000 r/min離心5 min，重復離心洗滌兩次;將處理好的細胞經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾，PI 染色后在流式細胞儀上測定細胞凋亡率及細胞周期。

1.2.4 Western-blot 實驗 各組細胞提取蛋白后，經(jīng)100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離電轉(zhuǎn)移至PVDF 濾膜上。濾膜經(jīng)室溫封閉1 h 后，加入一抗4℃孵育過夜，再與HRP 標記的二抗室溫溫育1 h，漂洗后BAD 試劑盒顯色。結(jié)果使用Bio-rad公司Quantity One 軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)均用±s 表示，應用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 白藜蘆醇對不同ER 亞型MCF-7 細胞增殖活性的影響 0.1 μmol/L 白藜蘆醇作用的各組細胞增殖活性較溶劑對照組明顯增高，第5 天達峰值;與MCF-7組相比，不同亞型細胞的增殖活性表現(xiàn)為ERβ+＜MCF-7＜ERα+(表1)。同時應用流式細胞術檢測0.1 μmol/L 白藜蘆醇對各亞型細胞作用24、48 h 后各周期分布變化的情況發(fā)現(xiàn)，作用24 h 后ERα+細胞S 期比例較溶劑對照組和MCF-7組明顯增加(P＜0.05);ERβ+細胞G0/G1期比例較溶劑對照組和MCF-7組增加，且增加程度隨時間延長而顯著(P＜0.05，表2)。

表1 白藜蘆醇對各受體亞型MCF-7 細胞作用不同時間的增殖影響 (n=3;)

表1 白藜蘆醇對各受體亞型MCF-7 細胞作用不同時間的增殖影響 (n=3;)

表2 白藜蘆醇對各受體亞型MCF-7 細胞周期分布的影響 (n=3;;%)

表2 白藜蘆醇對各受體亞型MCF-7 細胞周期分布的影響 (n=3;;%)

注:與溶劑對照組比較，①P＜0.05;與MCF-7 細胞組比較，②P＜0.05

2.2 白藜蘆醇對不同ER 亞型MCF-7 細胞信號通路相關蛋白表達的影響 0.1 μmol/L 白藜蘆醇作用48 h 后，可明顯提高ERα+細胞ERK 和AKT蛋白磷酸化程度，減少p38 磷酸化蛋白的表達(P＜0.05);ERβ+細胞經(jīng)白藜蘆醇作用后其ERK 蛋白磷酸化明顯減少，p38 蛋白磷酸化明顯增加(P＜0.05，表3)，ERα+細胞組bcl-2 和caspase-3 蛋白表達較各組變化明顯(P＜0.05);ERβ+細胞中caspase-3蛋白表達較各組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表3)。

表3 白藜蘆醇對各受體亞型MCF-7 細胞相關蛋白表達的影響 (n=3;)

表3 白藜蘆醇對各受體亞型MCF-7 細胞相關蛋白表達的影響 (n=3;)

注:與溶劑對照組比較，①P＜0.05;與MCF-7 細胞組比較，②P＜0.05

3 討 論

ER 包括ERα、ERβ 兩種亞型，含有6個功能區(qū)(A-F)。在體內(nèi)ER 通常以異/同二聚體的形式發(fā)揮作用，兩種亞型的氨基酸序列和基因序列有很高的同源性，但同時也有不同的轉(zhuǎn)錄激活功能［8，9］。ERα、ERβ 結(jié)構的不同決定了功能上的差異。

MTT 實驗結(jié)果顯示，經(jīng)0.1 μmol/L 白藜蘆醇作用后，各組細胞的增殖活性均高于溶劑對照組，說明白藜蘆醇促細胞增殖作用明顯;且ERα+細胞增殖活性高于MCF-7 細胞和ERβ+細胞，而ERβ+細胞增殖活性低于MCF-7 細胞，由此推測白藜蘆醇可能通過作用于ERα 而發(fā)揮促增殖作用。由流式細胞術檢測白藜蘆醇對各組細胞周期分布情況的結(jié)果可見，白藜蘆醇作用ERα+細胞后使其S 期比例明顯增大;而與ERβ+細胞作用后G0/G1期比例明顯增大，結(jié)合MTT 結(jié)果可推測，白藜蘆醇促細胞增殖作用可能是與ERα 結(jié)合后增加了細胞DNA 合成;而其與ERβ 結(jié)合后，細胞周期阻滯于G0/G1期，降低了細胞的增殖活性。

以往研究認為，E2主要通過與細胞內(nèi)受體結(jié)合，使受體發(fā)生變構后與相關基因結(jié)合，通過調(diào)節(jié)相關基因的表達而實現(xiàn)其功能，這就是傳統(tǒng)上所謂的雌激素作用機制。雌激素還具有非基因組作用機制，該機制多與胞質(zhì)內(nèi)蛋白激酶系統(tǒng)的激活等有關。有研究發(fā)現(xiàn)，E2能夠通過ERα 瞬時激活P38/MAPK、ERK/MAPK 和P13/AKT 通路。ERK/MAPK和P13/AKT 的磷酸化可以協(xié)同提高bcl-2 的表達水平，從而減少在P38/MAPK 激活過程中損失的Ca2+水平［10］;而在ERβ 存在的情況下，E2則只能持續(xù)激活P38/MAPK，并促進caspase-3 的激活［11］。由western-blot 結(jié)果推測，白藜蘆醇可通過MAPK 和P13/AKT 通路與ER 結(jié)合來調(diào)節(jié)細胞增殖活性，同時也能通過調(diào)節(jié)下游關鍵因子bcl-2 和caspase-3表達而影響細胞增殖。

筆者前期實驗證實，低濃度白藜蘆醇有促MCF-7細胞增殖的作用［7］，由本研究結(jié)果推測可能是其與細胞內(nèi)ERα 結(jié)合共同作用的結(jié)果。進而可推測低濃度白藜蘆醇與ERα 親和力較強，當與ERα結(jié)合后，可激活MAPK 和Akt，同時上調(diào)bcl-2 并下調(diào)caspase-3 蛋白表達水平，發(fā)揮其促增殖作用。白藜蘆醇與ERβ 結(jié)合后對細胞作用則相反。由此可見，白藜蘆醇對MCF-7 細胞的雙相調(diào)節(jié)作用與ER 不同亞型親和力有關。這也為今后開發(fā)針對激素依賴性疾病用藥提供了一定的理論依據(jù)。

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