姚志華，苑亞東，劉艷艷，郭宏強，趙 燕，姚書娜，楊樹軍

1鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院內科，鄭州450008

2武警河南總隊醫(yī)院神經外科，鄭州450052

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤中居第5位，嚴重危害人類生命健康。研究表明，環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)的過表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，而COX-2抑制劑對多種腫瘤均有較強的抑制作用，且與其他常規(guī)化療藥物聯用具有協同作用［1］。本研究采用選擇性COX-2抑制劑塞來昔布與氟嘧啶類抗腫瘤藥物卡培他濱聯合用于H22肝癌細胞移植瘤小鼠，觀察腫瘤抑制作用并探討其作用機制，以期為臨床應用提供理論依據。

材料和方法

材料人肝癌H22細胞株購自中國科學院上海細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(37℃、5%CO2)，采用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。BALB/c裸鼠，清潔級，體重 (20±2)g，雌雄各半，購自河南省實驗動物中心，許可證號:SYXK(豫)2005-0012。塞來昔布膠囊 (西樂葆)購自美國輝瑞公司，卡培他濱 (希羅達)購自上海羅氏公司，小牛血清購自杭州四季青公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，兔抗小鼠COX-2、核轉錄因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)p65 和β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，HRP標記的羊抗兔IgG購自上?？党缮锟萍加邢薰荆琓rizol試劑購自美國Introvigen公司，PCR試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

小鼠皮下移植瘤模型無菌環(huán)境下，吸取處于對數生長期的H22細胞制備單細胞懸液，無菌生理鹽水調整至細胞濃度為1×107/ml，接種于BALB/c小鼠右前肢腋窩皮下，每只小鼠的接種量為0.2 ml，制備小鼠H22移植瘤模型。

動物分組及給藥40只模型小鼠隨機分為對照組、塞來昔布組、卡培他濱組和聯合干預組4組，每組10只。塞來昔布以100 mg/kg灌胃［2］，卡培他濱以755 mg/kg(相當于最大耐受量2.1 mmol/kg)灌胃［3］，聯合干預組同時給予塞來昔布和卡培他濱，給藥劑量及途徑與單獨用藥組相同。對照組灌胃等量生理鹽水。從接種后第3天起，每天給藥1次，連續(xù)15 d。

指標檢測末次給藥24 h后，脫頸處死小鼠，剝離完整腫瘤組織，生理鹽水漂洗干凈，吸水紙吸干水分后于電子天平稱重，記錄腫瘤重量 (瘤重)并計算抑瘤率。抑瘤率=(對照組瘤重-給藥組瘤重)/對照組瘤重×100%。采用熒光定量PCR和Western blotting分別檢測瘤組織中NF-κB p65和COX-2的mRNA及蛋白表達水平。

熒光定量PCR取新鮮瘤組織，采用Trizol試劑提取總RNA，反轉錄合成cDNA。采用熒光定量PCR方法檢測 NF-κB p65和 COX-2的 mRNA表達水平。NF-κB p65 上游引物:5’-ACCCCTTTCAAGTTCCCATAGA-3’，下游引物:5’-ACCTCAATGTCTTCTTTCTGCAC-3’;COX-2 上游引物:5’-GTCTGATGATGTATGCCACAATCTG-3’，下游引物:5’-GATGCCAGTGATAGAGG GTGTTAAA-3’;內參 β-actin 上游引物:5’-TGTGCCCATCTACGAGGGGTATGC-3’，下游引物:5’-GGTA CATGGTGGTGCCGCCAGACA-3’。引物由生興生物技術(南京)有限公司合成。采用 2-ΔΔCT法分析結果［4］。

Western blotting取瘤組織約100 mg，加入10倍體積的RIPA組織蛋白裂解液，勻漿機勻漿后，于12 000×g離心20 min，吸取上清液，棄沉淀。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量?？偟鞍?(約50 μg)經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，并轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h，分別加入兔抗小鼠NF-κB p65和COX-2的一抗，按照體積比1∶1000稀釋，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入HRP標記的二抗，室溫下孵育4 h，TBST漂洗3次，每次5 min。采用ECL法顯影并壓片。采用Quantity One v4.62軟件分析條帶灰度值，結果以目的條帶與內參β-actin的相對灰度值表示。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，結果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

對抑瘤率的影響塞來昔布和卡培他濱組的平均瘤重均較對照組顯著降低 (P＜0.01，P＜0.001)，兩組抑瘤率分別為30.2%和49.9%。聯合干預組的抑瘤率高達75.4%，平均瘤重明顯低于塞來昔布組和卡培他濱組 (P＜0.01，P＜0.05)(表1)。

對NF-κB和COX-2的mRNA表達的影響NF-κB p65的mRNA表達水平在各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。塞來昔布和聯合干預組顯著抑制了COX-2的mRNA表達，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義 (P均＜0.001)，卡培他濱對COX-2的mRNA表達無明顯影響 (圖1)。

對NF-κB p65和COX-2蛋白表達的影響塞來昔布組和聯合干預組NF-κB和COX-2的蛋白表達水平較對照組均顯著下降 (P＜0.05);卡培他濱亦可減少NF-κB和COX-2的表達，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)(圖2)。

表1 塞來昔布和卡培他濱對抑瘤率的影響 (n=10)Table 1 Effects of celecoxib and capecitabine on tumor inhibition rate(n=10)

圖1 塞來昔布和卡培他濱對NF-κB p65和COX-2的mRNA表達的影響Fig 1 Effects of celecoxib and capecitabine on mRNA expression of NF-κB p65 and COX-2

圖2 塞來昔布和卡培他濱對NF-κB p65和COX-2蛋白表達的影響Fig 2 Effects of celecoxib and capecitabine on protein expression of NF-κB p65 and COX-2

討 論

COX-2是催化花生四烯酸合成前列腺素的關鍵限速酶，眾多研究表明，COX-2在多種癌組織中高度表達［5］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關。COX-2抑制劑塞來昔布具有廣泛的抗腫瘤效應［6-7］，臨床研究顯示，塞來昔布與5-氟尿嘧啶聯合用于治療多耐藥性肝細胞癌可顯著增強抑瘤效果［8］，提示塞來昔布用于聯合化療具有巨大的應用前景。卡培他濱是一種新型的抗腫瘤藥物，在體內可轉化為5-氟尿嘧啶后發(fā)揮抗腫瘤效應，臨床常用于治療乳腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、食管癌等，近來發(fā)現卡培他濱對肝癌亦有良好的治療作用［9］。既往研究表明，卡培他濱與塞來昔布聯合化療晚期結直腸癌可有效控制疾病進展并減輕不良反應［10］，但兩藥聯合用于肝癌則鮮有報道。本研究結果顯示，塞來昔布和卡培他濱兩藥單用均可抑制肝癌H22小鼠瘤組織的生長，抑瘤率分別為30.2%和49.9%，而聯合干預組抑瘤率高達75.4%，療效顯著優(yōu)于單藥治療，提示塞來昔布和卡培他濱兩藥聯用治療肝癌H22小鼠具有協同效應。

NF-κB是COX-2的重要上游調節(jié)因子，在炎癥、腫瘤等過程中發(fā)揮關鍵作用。多種致癌因子均可通過上調NF-κB的表達，刺激細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進腫瘤的浸潤轉移。生理狀況下，NF-κB是由p65和p50兩個亞基以及抑制性蛋白IκB結合為三聚體形式存在，當被白細胞介素-1、內毒素等激活后，IκB脫離下來，活化的二聚體進入細胞核內，與DNA特定識別序列結合，調節(jié)靶基因轉錄，刺激腫瘤細胞大量增殖，其中p65是起關鍵作用的催化亞基。抑制NF-κB可促進腫瘤細胞凋亡，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。研究發(fā)現，塞來昔布作為COX-2選擇性抑制劑，可抑制人肝癌細胞 HeG2中 NF-κB和COX-2表達［11］。本研究結果表明，塞來昔布和聯合干預組NF-κB p65和COX-2的蛋白表達水平均較對照組顯著下降，而卡培他濱組NF-κB p65和COX-2的表達則無明顯變化，提示塞來昔布與卡培他濱具有不同的抗腫瘤機制，兩藥聯用可通過不同的途徑在抑制腫瘤生長方面發(fā)揮協同作用。

綜上，本研究結果提示，塞來昔布可通過抑制NF-κB p65和COX-2的表達，增強卡培他濱的抗腫瘤效應，兩藥聯用具有良好的協同增效作用，為臨床治療肝癌提供了理論依據。

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