周 建，葛寶豐，甄 平，馬小妮，閆麗娟，郭曉宇，成 魁，高玉海，石文貴，陳克明

中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州 730050

蛇床子是傘形科植物蛇床的果實(shí)，中醫(yī)認(rèn)為其具有溫腎助陽(yáng)、祛風(fēng)燥濕、殺蟲止癢之功效。明磊國(guó)等［1-3］研究顯示蛇床子素能促進(jìn)體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化，以及促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化成熟和抑制破骨細(xì)胞吸收活性，因此推測(cè)蛇床子素具有促進(jìn)骨代謝的活性作用，但是缺少體內(nèi)和更接近體內(nèi)藥物代謝的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，因?yàn)樗幬镌隗w內(nèi)對(duì)骨骼調(diào)節(jié)是一個(gè)針對(duì)成骨、破骨、骨髓間充質(zhì)和骨細(xì)胞的復(fù)合體，本研究應(yīng)用體外大鼠股骨組織培養(yǎng)模型，此模型具有實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單和藥物代謝過(guò)程更接近體內(nèi)藥物代謝的過(guò)程，因此本研究以雌二醇為陽(yáng)性對(duì)照藥物從組織水平探討蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)股骨組織代謝活性的影響。

材料和方法

材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠［甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK(甘)2010-0006-152］。胎牛血清 (蘭州民海生物公司);DMEM培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶 (Gibco公司，美國(guó));總RNA提取裂解液 Reagent kit、Prime ScriptTM SYBR?Premix Ex TaqTMⅡPCR擴(kuò)增試劑盒 (大連寶生物公司);青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶 (Sigma公司，美國(guó));2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉，蛋白定量試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司);堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);鈣含量測(cè)定試劑盒(BioVision，美國(guó));蛇床子素雌二醇為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的對(duì)照品 (純度＞99%);其余試劑均為分析純。

大鼠股骨組織的培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)于甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，取1月齡 (80±5)g SD雄性大鼠6只，處死后放入75%酒精浸泡10 min，取股骨，去除肌肉、血管及結(jié)締組織，用無(wú)菌PBS沖洗骨髓腔，棄掉骨髓，然后將股骨剪成約1 mm3的骨片，PBS反復(fù)沖洗骨片，棄掉沖洗液后，然后0.25%的胰蛋白酶消化10 min，徹底去除軟組織，棄掉消化液，然后用無(wú)菌PBS漂洗兩次，用含有10%胎牛血清的DMEM(4.5 g/L葡萄糖)培養(yǎng)液37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，具體培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn) ［4］。

最佳藥物濃度篩選 在股骨組織培養(yǎng)48 h后采用不同濃度 (1×10-4～1×10-8mol/L)雌二醇和蛇床子素分別處理體外培養(yǎng)的大鼠股骨組織，在藥物處理后第9天PBS漂洗骨片，加入1.5 ml組織裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2、150 mmol/L NaCl、100 mg/L苯甲基磺酰氟、1 mg/L抑蛋白酶肽、1%Tween-100、0.5%去氧膽酸鈉)，用勻漿器勻漿股骨組織成乳液狀，然后超聲處理15 s，低溫靜置30 min后1000 r/min離心5 min(轉(zhuǎn)子半徑6 cm)，棄掉沉淀，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中蛋白濃度，然后取相同質(zhì)量的總蛋白分別測(cè)定各組堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)活性，ALP活性測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，每組分別按緩沖液∶基質(zhì)液=1∶1加入充分搖勻;37℃水浴15 min，加入3倍于基質(zhì)液顯色液，充分混勻顯色后，測(cè)定502 nm處吸光度值，經(jīng)過(guò)計(jì)算換算ALP活性 (U/g蛋白)［5］，每個(gè)濃度3次平行實(shí)驗(yàn)，每次6個(gè)重復(fù)。

分組處理 在骨組織培養(yǎng)48 h后，隨機(jī)編號(hào)分為3組，分別為含終濃度為1×10-5mol/L蛇床子素組、含終濃度為1×10-8mol/L雌二醇組和對(duì)照組。

ALP活性測(cè)定 在加藥后的第3、6、9、12、15和18天PBS漂洗骨片，方法同最佳藥物濃度篩選和ALP活性的測(cè)定方法。

鈣含量測(cè)定 體外培養(yǎng)的股骨組織加蛇床子素處理后的第3、6、9、12、15和18天，PBS漂洗骨片，然后將骨片放入烘箱中100℃烘烤48 h，烘烤后稱量其干重。再向骨片中加入1 ml 1 mol/L的鹽酸勻漿，用勻漿器勻漿股骨組織后振蕩過(guò)夜，消化液1000 r/min離心5 min(轉(zhuǎn)子半徑6 cm)取上清液。測(cè)定鈣鹽含量，樣本測(cè)定按照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行。每孔加入50 μl上清液，然后樣本及標(biāo)準(zhǔn)孔加入90 μl的顯色基質(zhì)液，充分混勻后加入60 μl的鈣含量分析緩沖液，室溫下反應(yīng)10 min，570 nm處測(cè)定吸光度值。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中鈣含量，結(jié)果表示為:測(cè)定勻漿中鈣的總質(zhì)量/烘干后大鼠股骨組織的質(zhì)量。

基因表達(dá)水平分析

總RNA提取:骨片在蛇床子素處理培養(yǎng)后的第3、6、9、12、15和18天后棄培養(yǎng)液，無(wú)酶PBS漂洗2次，加入1 ml總RNA提取裂解液，裂解勻漿骨片，收集勻漿液，1000 r/min離心5 min，取上清液加入200 μl氯仿4℃ 12 000 r/min離心15 min(轉(zhuǎn)子半徑1.5 cm)，取上清液加入等體積的異丙醇靜置15 min，4℃12 000 r/min離心15 min(轉(zhuǎn)子半徑1.5 cm)棄上清液，75%乙醇重懸浮沉淀4℃ 12 000 r/min離心5 min(轉(zhuǎn)子半徑1.5 cm)，棄上清后-70℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，在230、260、280和320 nm處測(cè)定吸光度值，調(diào)整總RNA的濃度。

逆轉(zhuǎn)錄:使用Prime ScriptTMreagent Kit(TakaRa Code:DRR037A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成反轉(zhuǎn)錄出第一條cDNA鏈。反應(yīng)體系:5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μl，多聚 T 引物 (50 μmol/L)1.0 μl，隨機(jī)引物(100 μmol/L)1.0 μl，總 RNA 10 μl(1000 ng)補(bǔ)無(wú)酶水至20 μl。37℃反應(yīng)15 min，85℃ 5 s，-20℃保存。

引物設(shè)計(jì):根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，在GenBank查詢所需要基因的目的序列mRNA序列，引物均由寶生物 (大連)公司根據(jù)序列設(shè)計(jì)并合成。人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因2:NM_053470.1上游引物5’-GCACCCAGCCCATAATAGA-3’，下游引物 5’-TTGGAGCAAGGAGAACCC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度165 bp;核因子κB受體活化因子配體:NM_053356上游引物 5’-TTCCCGGTGAATTCGGTCTC-3’，下游引物 5’-ACCTCGGATTCCAATAGGACCAG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度107 bp;骨保護(hù)素 (osteoprotegerin，OPG):NM_057149.1上游引物5’-GCAGCATCGCTCTGTTCCTGTA-3’，下游引物 5’-GCATGAGTCAGGTAGTGCTTCTGTG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度164 bp;GAPDH:NM_017 008.3上游引物5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游引物 5’-ATG GTGGTGAAGACGCCAGTA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度143 bp。

PCR反應(yīng)體系:為20 μl，包括:SYBR Premix Ex Taq TMⅡ (2 × )10 μl; 上游引物(10 μmol/L)0.8 μl;下游引物 (10 μmol/L)0.8 μl;ROX參照熒光 (50×)0.4 μl;cDNA 模板 2 μl;dH2O 6 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，60℃退火31 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)收集熒光信號(hào)。隨后緩慢升溫，95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，溫度變化速度為0.1℃/s，繪制PCR產(chǎn)物的溶解曲線，了解擴(kuò)增的特異性。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR數(shù)據(jù)分析:采用△△Ct處理數(shù)據(jù)，2-△△Ct表示數(shù)據(jù)的結(jié)果，具體方法參考文獻(xiàn) ［6］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。首先用方差分析檢驗(yàn)各組間差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，用多參數(shù)t-檢驗(yàn)驗(yàn)證各均數(shù)間差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

最佳藥物濃度 最佳的藥物濃度為:蛇床子素1×10-5mol/L、雌二醇1×10-8mol/L(圖1)。

蛇床子素對(duì)ALP活性的影響 蛇床子素組和雌二醇組ALP活性第3～9天呈升高趨勢(shì)，第9～18天降低，第9天達(dá)到最高;與對(duì)照組相比，蛇床子素組和雌二醇組在第3、6和9天顯著高于對(duì)照組 (P＜0.01);但在第12、15和18天時(shí)，蛇床子素組和雌二醇組ALP活性與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖2)。

蛇床子素對(duì)鈣鹽沉積量的影響 第3、6、15、18天蛇床子素組和雌二醇組鈣鹽含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)，第12天顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，第9天3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(圖3)。

成骨性基因表達(dá) 蛇床子素組和雌二醇組第3～6天逐漸升高，第6～18天逐漸降低，第6天時(shí)達(dá)到最高。蛇床子素組和雌二醇組在處理股骨組織第3、6、9和15天時(shí)顯著促進(jìn)Runx-2 mRNA的表達(dá) (P＜0.05，P＜0.01)，處理第12天時(shí)顯著抑制 Runx-2 mRNA的表達(dá) (P＜0.01)(圖4)。

圖1 用堿性磷酸酶活性篩選最佳的藥物濃度Fig 1 The optimal doses of osthole and estradiol were screened based on alkaline phosphatase activity

圖2 藥物處理股骨組織3、6、9、12、15和18 d堿性磷酸酶活性測(cè)定Fig 2 The alkaline phosphatase activity was measured 3，6，9，12，15，and 18 day after drug treatment

圖4 蛇床子素和雌二醇對(duì)股骨組織人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因-2 mRNA的表達(dá)Fig 4 The Runx-related gene-2 mRNA expression in femur tissues after osthole and estradiol treatment

蛇床子素組和雌二醇組在處理股骨組織第3、9、15天時(shí)顯著促進(jìn)OPG mRNA的表達(dá) (P＜0.05，P＜0.01)，在第6和12天時(shí)能顯著抑制OPG mRNA的表達(dá) (P＜0.05)(圖5)。

蛇床子素組和雌二醇組在處理股骨組織第6和9天時(shí)能顯著促進(jìn)核因子κB受體活化因子配體 mRNA的表達(dá) (P＜0.01)，第3、12、15和18天時(shí)能顯著抑制核因子κB受體活化因子配體mRNA的表達(dá) (P＜0.05，P ＜0.01)(圖6)。

蛇床子素組和雌二醇組在處理股骨組織第6和15天時(shí)能顯著促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 mRNA的表達(dá) (P＜0.01)，第9和12天時(shí)能顯著抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 mRNA的表達(dá) (P＜0.01)。蛇床子素組在第3和18天時(shí)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。雌二醇組處理第18天時(shí)能顯著抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 mRNA的表達(dá) (P＜0.05)，第3天時(shí)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(圖7)。

圖5 蛇床子素和雌二醇對(duì)股骨組織骨保護(hù)素mRNA的表達(dá)Fig 5 The osteoprotegerin mRNA expression in femur tissues after osthole and estradiol treatment

圖6 蛇床子素和雌二醇對(duì)股骨組織核因子κB受體活化因子配體mRNA的表達(dá)Fig 6 The receptor activator of nuclear factor-κB ligand mRNA expression in femur tissues after osthole and estradiol treatment

圖7 蛇床子素和雌二醇對(duì)股骨組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 mRNA的表達(dá)Fig 7 The bone morphogenetic protein-2 mRNA expression in femur tissues after osthole and estradiol treatment

討 論

有報(bào)道終濃度為1×10-5mol/L蛇床子素能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨性分化［1］，抑制破骨細(xì)胞的成熟［2-3］。本研究在已有的股骨組織體外培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上［4］，應(yīng)用骨組織體外培養(yǎng)模型進(jìn)行蛇床子素體外代謝活性研究，此模型快速、簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果。目前研究比較清楚的雌二醇具有抗骨質(zhì)疏松作用，因此本研究以雌二醇為陽(yáng)性對(duì)照藥物，通過(guò)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，確保股骨組織體外培養(yǎng)模型的可行性和恰當(dāng)性。在體外培養(yǎng)的股骨組織水平篩選了最佳的藥物濃度，蛇床子素和雌二醇的最佳濃度分別為1×10-5mol/L和1×10-8mol/L，本研究采用終濃度為1×10-5mol/L蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)大鼠股骨組織進(jìn)行干預(yù)，以研究蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠股骨組織骨形成活性的調(diào)節(jié)，檢測(cè)蛇床子素處理后股骨組織中ALP的活性、鈣含量以及骨形成活性的相關(guān)基因的表達(dá)。

ALP的活性是檢測(cè)成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志性指標(biāo)以及骨形成活性的標(biāo)志性指標(biāo)［7］，有研究顯示蛇床子素和雌二醇能顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞ALP活性［1］。本研究顯示蛇床子素組和雌二醇組的ALP活性從第3～9天顯著高于對(duì)照組，第12天活性降低，這可能與ALP是一個(gè)骨形成的早期指標(biāo)有關(guān)。鈣鹽是骨骼的主要成分，因此鈣鹽的沉積量也就成了衡量骨代謝活性的一個(gè)重要指標(biāo)，本研究觀察了蛇床子素和雌二醇對(duì)體外培養(yǎng)股骨組織鈣含量的影響，在體外培養(yǎng)股骨組織第3天時(shí)鈣的沉積達(dá)到最高，從第6～18天蛇床子素處理組鈣含量基本保持在一個(gè)相對(duì)恒定的水平，但第9和12天之間鈣鹽是一個(gè)關(guān)鍵的時(shí)間點(diǎn)鈣鹽，蛇床子素先是促進(jìn)Ca的沉積，到抑制鈣鹽沉積，再到第15天時(shí)促進(jìn)鈣鹽沉積，因此筆者推測(cè)蛇床子素能維持骨骼的代謝活性處在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，但促進(jìn)Ca的沉積存在時(shí)效關(guān)系。

骨骼的代謝過(guò)程受到多種基因和蛋白的調(diào)控，因此本研究檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)股骨組織中Runx-2、RANKL、OPG、BMP-2 mRNA含量的水平，以期望從基因水平檢測(cè)蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)股骨組織代謝活性的影響差異。其中，Runx-2是一個(gè)重要的成骨的轉(zhuǎn)錄因子，在骨代謝活性中發(fā)揮重要作用［8］。本研究顯示蛇床子素和雌二醇能促進(jìn)Runx-2的表達(dá)，但是先是升高之后降低;RANKL和OPG是一對(duì)骨形成與骨吸收的關(guān)鍵性基因，但OPG升高時(shí)骨形成大于骨吸收，當(dāng)RANKL升高時(shí)骨吸收大于骨形成［9-12］，本研究表明蛇床子素和雌二醇在體外培養(yǎng)股骨組織先是抑制、之后促進(jìn)、然后又抑制RANKL mRNA表達(dá)水平的過(guò)程，蛇床子組對(duì)OPG mRNA表達(dá)水平先是促進(jìn)、之后抑制、然后促進(jìn)，表明蛇床子素和雌二醇對(duì)體外培養(yǎng)先是促進(jìn)骨形成、然后促進(jìn)骨吸收、然后促進(jìn)骨形成的過(guò)程，因此可能是蛇床子素促進(jìn)骨形成和骨吸收存在一個(gè)時(shí)效關(guān)系。BMP-2作為骨代謝活性的一個(gè)重要的活性因子［13］，結(jié)果表明BMP-2的表達(dá)水平先升高、然后逐漸降低、又升高，進(jìn)一步表明蛇床子素和雌二醇對(duì)骨形成調(diào)節(jié)存在一個(gè)時(shí)效關(guān)系。

本研究在組織水平上探討蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)的股骨組織活性的影響，通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)ALP活性、鈣含量骨代謝相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè)，證明蛇床子素能調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的股骨組織的骨代謝活性，綜合各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，蛇床子素能調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)股骨組織的代謝活性，但是各項(xiàng)指標(biāo)表明在藥物處理后的第9和12天是蛇床子素調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，即蛇床子素調(diào)節(jié)骨代謝存在一個(gè)時(shí)效效應(yīng)。有關(guān)蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)大鼠股骨組織代謝活性調(diào)節(jié)的研究報(bào)道較少，因此本研究在組織水平為蛇床子素調(diào)節(jié)骨代謝活性提供了一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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