柴 笑，趙明峰，李德冠，孟娟霞，盧文藝，穆 娟，孟愛民

1天津醫(yī)科大學 一中心臨床學院 天津市第一中心醫(yī)院血液科，天津300192

2中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 放射醫(yī)學研究所放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學天津市重點實驗室，天津300192

鐵過載是鐵代謝紊亂的疾病。臨床上分特發(fā)性和繼發(fā)性，特發(fā)性是先天性代謝障礙導致體內(nèi)鐵過度蓄積，為常染色體隱性遺傳;繼發(fā)性血色病常因大量輸血、長期內(nèi)服鐵劑、慢性酒癖并攝入含鐵飲食或某些血液病等導致。鐵過載可引起廣泛纖維化及臟器功能損害，嚴重影響患者生存質(zhì)量甚至死亡。無論是遺傳性的地中海貧血還是獲得性的骨髓增生異常綜合征，輸血依賴的患者都有更高的發(fā)病率和死亡率，且與鐵過載的程度非常相關，因此鐵過載越來越成為臨床醫(yī)生關注的熱點［1］。但是由于臨床患者個體差異性較大，取材所限，可重復性差，很難深入研究鐵過載對骨髓造血功能的作用及機制。本研究探索性地使用動物模型去模擬臨床情況，首先建立小鼠鐵過載模型，然后檢測其骨髓造血功能的變化，為深入研究鐵過載對骨髓造血功能的作用及機制提供實驗基礎。

材料和方法

材料 動物:C57BL/6純系小鼠40只，雄性，體重20～22 g，購自中國食品藥品檢定研究院，合格證號:SCXK(京)2009-0017，小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所SPF級動物房。試劑及儀器:右旋糖酐鐵注射液購自丹麥Pharmacosmos廠家，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物公司，甲基纖維素培養(yǎng)基MethoCult?GF M3434購自StemCell公司，鈣熒光素乙酰氧基甲酯 (Calcein-AM)購自美國Sigma公司，16#平頭注射器針頭，日本Olympus倒置顯微鏡，美國Beckman Coulter Altra流式細胞儀，日本Sysmex poch100i全自動血細胞分析儀。

分組及處理 使用隨機區(qū)組法將C57BL/6小鼠隨機分為4組:對照組10只，每次腹腔注射生理鹽水0.2 ml;低劑量鐵劑組10只，每次腹腔注射質(zhì)量濃度為12.5 mg/ml的右旋糖酐鐵0.2 ml;中劑量鐵劑組10只，每次腹腔注射質(zhì)量濃度為25 mg/ml的右旋糖酐鐵0.2 ml;高劑量鐵劑組10只，每次腹腔注射質(zhì)量濃度為50 mg/ml的右旋糖酐鐵0.2 ml。每3天注藥1次，在給藥6周后處死小鼠。

血細胞計數(shù) 摘除眼球取血并用K3EDTA抗凝，用全自動血細胞分析儀檢測每組10只小鼠的白細胞、血小板、血紅蛋白和紅細胞。

病理組織學檢查 頸部脫臼處死小鼠，取各組小鼠肝臟、脾臟及胸骨。(1)肉眼觀察; (2)光鏡觀察:常規(guī)切片，蘇木精-伊紅染色，400倍鏡下觀察其病理形態(tài)學改變;普魯士藍鐵染色，油鏡下觀察骨髓鐵的分布情況。

骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)分離及計數(shù) 無菌剪刀和鑷子分離出雙側股骨和脛骨，利用滅菌過的剝骨紙和鑷子把小鼠骨頭上肌肉剔除干凈，用剪刀剪除骨頭兩端少許，將每只小鼠的單側股骨放至含1 ml Hank’s液的Ep管中，沖洗骨髓腔，收集單細胞懸液，用全自動血細胞分析儀計數(shù)BMMNCs。收集每組小鼠的股骨和脛骨，放入冰上含有7～8 ml Hank’s液的無菌玻璃平皿中，用無菌注射器把骨髓沖入無菌玻璃平皿中，并用注射器反復吹打細胞溶液3次，把骨髓吹打成單細胞懸液。按淋巴細胞分離液∶細胞懸液 =1∶2進行分離，得到的BMMNCs用Hank’s液離心洗滌2次，最后棄去上清，先加入1～2 ml完全培養(yǎng)基 (含20%胎牛血清，1%青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基)徹底蕩起沉淀，然后加到合適體積后計數(shù)，稀釋到所需濃度用于以下實驗。

BMMNCs內(nèi)不穩(wěn)定鐵(labile iron pool，LIP)的檢測 Calcein-AM是一種膜滲透性螯合劑，它能進入活細胞內(nèi)被酯酶分解，釋放出Calcein發(fā)出強綠色熒光。如果細胞存在LIP，LIP能與Calcein可逆性結合，進而淬滅其熒光。本研究用Calcein-AM標記不同處理組細胞，通過檢測Calcein的平均熒光強度 (mean fluorescent intensity，MFI)反映細胞內(nèi) LIP水平［2］。將各組 BMMNCs濃度調(diào)整為 1×106/ml，取 100 μl即1×105個細胞，加20 μl Calcein-AM，37℃避光孵育10 min，用預冷的PBS離心洗滌2次，流式細胞儀檢測各組BMMNCs的MFI。

BMMNCs集落培養(yǎng) 收集各組BMMNCs，并將濃度調(diào)整為2×105/ml，加200 μl細胞至2 ml M3434，振蕩器充分混勻，4℃靜置30 min，待氣泡消失，用注射器連接16#平頭注射器針頭，吸取500 μl細胞混懸液，加入24孔板，輕搖培養(yǎng)板，使培養(yǎng)基均勻分布。將培養(yǎng)板放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～12 d，于倒置顯微鏡下進行觀察，低倍觀察集落形成情況，細胞數(shù)≥30為陽性集落，高倍鏡下對粒-單系集落形成單位數(shù)、紅系集落形成單位數(shù)、混合系集落形成單位數(shù)進行計數(shù)。

統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

鐵過載小鼠的一般表現(xiàn)

膚色:與對照組相比，低、中、高劑量鐵劑組小鼠在注藥第2周時，耳、腳爪、尾巴出現(xiàn)漸深的鐵銹色，牙齒呈黃褐色改變，且皮毛開始變得稀疏、粗糙、無光澤，并隨著時間的延長和劑量的增加，上述表現(xiàn)更加明顯。

行為改變:隨著注藥時間的延長及累積劑量的增加，低、中、高劑量鐵劑組小鼠活動減少，反應遲鈍，易受驚嚇，出現(xiàn)精神紊亂癥狀，且高劑量鐵劑組小鼠死亡4只。

體重改變:最初各組小鼠體重差異無統(tǒng)計學意義，隨著體內(nèi)累積劑量的增加，低、中、高劑量鐵劑組小鼠飲食明顯減少，生長緩慢，體重不增或下降，在第6周4組之間差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)(圖1)。

小鼠鐵過載模型的建立

肝臟HE染色:對照組小鼠肝臟未見明顯的病理改變，光鏡下細胞排列整齊、形態(tài)規(guī)則 (圖2A);低劑量鐵劑組小鼠肝臟肉眼未見明顯改變，光鏡下肝細胞排列雜亂，可見部分細胞胞漿出現(xiàn)褐色鐵沉積 (圖2B);中劑量鐵劑組小鼠肝臟肉眼可見輕度增大，水腫、淤血，光鏡下肝細胞可見團塊狀褐色鐵沉積 (圖2C);高劑量鐵劑組小鼠肝臟肉眼可見明顯淤血，整個肝臟呈深褐色，光鏡下肝細胞凝固性壞死，核固縮、溶解，胞漿內(nèi)滿布鐵顆粒 (圖2D)。

圖1 各組小鼠體重變化曲線圖Fig 1 Results of different groups mice weight change over days

脾臟HE染色:對照組小鼠脾臟未見明顯的病理改變，光鏡下細胞形態(tài)規(guī)則，可見脾小體 (圖3A);低劑量鐵劑組小鼠脾臟出現(xiàn)輕度淤血，光鏡下脾細胞排列雜亂，脾臟邊緣區(qū)及紅髄區(qū)出現(xiàn)褐色鐵沉積，呈放射狀分布，脾小體未受累 (圖3B);中劑量鐵劑組小鼠脾臟肉眼可見淤血水腫，光鏡下脾臟邊緣區(qū)及紅髄區(qū)可見團塊狀褐色鐵沉積 (圖3C);高劑量鐵劑組小鼠脾臟肉眼可見明顯淤血，整個脾臟呈深褐色，光鏡下脾臟滿布鐵顆粒，脾小體與紅髄區(qū)界限不清 (圖3D)。

骨髓活檢HE染色及普魯士藍鐵染色:對照組小鼠骨髓光鏡下細胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則;普魯士藍鐵染色未見被染成藍色的鐵 (圖4A1、4A2)。低劑量鐵劑組骨髓光鏡下未見明顯鐵顆粒;鐵染色細胞內(nèi)外均可見少量被染成藍色的鐵顆粒 (圖4B1、4B2)。中劑量鐵劑組骨髓可見細胞外有若干棕色鐵顆?；驁F塊，呈梭形或不規(guī)則狀;鐵染色細胞內(nèi)外均可見被染成藍色的鐵顆?；驁F塊 (圖4C1、4C2)。高劑量鐵劑組骨髓細胞外有大量鐵存在，呈塊狀;鐵染色可見視野滿布藍色鐵團塊 (圖4D1、4D2)。

BMMNCs內(nèi)LIP由于細胞內(nèi)存在的LIP可以淬滅熒光探針Calcein，因此根據(jù)Calcein的MFI強弱測定各組細胞內(nèi)LIP的相對水平。對照組MFI 41.44±5.53，低劑量鐵劑組MFI 39.8±5.94，中劑量鐵劑組MFI 38.42±6.76，高劑量鐵劑組38.33±6.15，4組之間差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。

骨髓造血細胞集落形成能力的變化 低、中、高劑量鐵劑組小鼠骨髓細胞粒-單系集落形成單位數(shù)和對照組相比均顯著下降 (P＜0.05)，中、高劑量鐵劑組小鼠骨髓細胞紅系集落形成單位數(shù)、混合系集落形成單位數(shù)和對照組相比顯著下降 (P＜0.05)(圖5)。

BMMNCs計數(shù) 對照組BMMNCs計數(shù) (30.87±3.61)×106/Femur，低劑量鐵劑組 (28.41±3.80)×106/Femur，中劑量鐵劑組 (27.64±1.65)×106/Femur，高劑量鐵劑組 (30.95±4.72)×106/Femur，4組骨髓有核細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。

外周血象的變化 和對照組相比，低、中、高劑量鐵劑組外周血白細胞、血小板、紅細胞、血紅蛋白差異均無統(tǒng)計學意義，血小板低、中、高劑量鐵劑組和對照組相比有輕度下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(表1)。

圖2 肝臟HE染色結果 (×400)Fig 2 HE staining of livers(×400)

圖3 脾臟HE染色結果 (×400)Fig 3 HE staining of spleens(×400)

圖4 骨髓HE染色 (A1～D1)(×400)及普魯士藍鐵染色 (A2～D2)(×1000)Fig 4 HE staining(A1-D1)(×400)and Prussian blue iron staining(A2-D2)(×1000)of bone marrow

圖5 各組小鼠造血集落形成單位數(shù)Fig 5 Hematopoietic colony-forming units of different groups

討 論

鐵過載 (血色病)是鐵代謝紊亂的疾病。鐵在體內(nèi)過度沉積，不但可導致重要臟器 (尤其是肝臟、脾臟、心臟和胰腺等)的結構損害和功能障礙，對骨髓造血及血液系統(tǒng)疾病的影響也不容樂觀。近年的一些臨床證據(jù)顯示鐵過載可抑制骨髓的造血功能［3-5］。由于臨床患者取材受限，可重復性差，個體差異性也較大，鐵過載機制研究進展緩慢，目前關于此方面的報道甚少。因此，建立小鼠鐵過載模型對深入研究鐵過載對骨髓造血功能的作用及機制有著重要的意義。

本研究通過給小鼠定期定量腹腔注射右旋糖酐鐵，成功建立了小鼠鐵過載模型。鐵過載模型小鼠肝臟、脾臟中可見大量鐵沉積，這與臨床鐵過載患者肝臟、脾臟鐵大量沉積是一致的，與朱航等［6］的研究結果類似，但是朱航等［6］側重于研究過量的鐵在體內(nèi)貯存對機體各臟器的損傷，對骨髓功能的影響未涉及。本研究創(chuàng)新性地對骨髓造血功能進行初步探索。骨髓活檢的結果顯示有大量鐵存在于骨髓基質(zhì)，BMMNCs內(nèi)LIP結果差異無統(tǒng)計學意義，更進一步表明骨髓鐵過載存在，但是鐵主要存在于骨髓基質(zhì)而非細胞內(nèi)，與筆者前期體外實驗的結果存在一定差異［7-8］。臨床鐵過載情況一般發(fā)生于骨髓損傷的患者如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征等輸血所致，這些患者的骨髓狀況本身是不好的，在此基礎上給予輸血容易導致鐵過載的發(fā)生。而本研究用的正常小鼠建立鐵過載模型，可能機體由于強大的代償機制未發(fā)現(xiàn)骨髓細胞鐵沉積，這是本研究鐵過載小鼠模型的不足之處。在病態(tài)骨髓的基礎上建立鐵過載模型，可能獲得與臨床繼發(fā)性鐵過載一致的結果。

表1 各組小鼠外周血象的改變 (n=10，±s)Table 1 Counts of peripheral blood cells(n=10，±s)

表1 各組小鼠外周血象的改變 (n=10，±s)Table 1 Counts of peripheral blood cells(n=10，±s)

組別Group 白細胞White blood cells(×109/L)血小板Platelets(×109/L)紅細胞Red blood cells(×109/L)血紅蛋白Hemoglobin(g/L)對照組Control group 8.43±0.24 926.0±28.23 8.94±0.08 135.3±1.21低劑量鐵劑組Low-dose iron group 8.73±0.83 780.7±39.60 8.86±0.21 146.8±6.01中劑量鐵劑組Middle-dose iron group 8.62±1.21 676.2±21.43 8.78±0.71 132.4±1.23高劑量鐵劑組High-dose iron group 8.27±0.89 587.3±19.67 8.65±0.97 131.9±4.62

在初步建立鐵過載小鼠模型的基礎上，本研究首先觀察了鐵過載對BMMNCs數(shù)目及功能的影響，發(fā)現(xiàn)集落形成單位數(shù)顯著下降，計數(shù)各組差異無統(tǒng)計學意義，表明鐵過載確實損傷了骨髓造血功能，進一步觀察外周血象的改變，結果顯示與對照組相比，各劑量鐵劑組差異均無統(tǒng)計學意義，僅血小板有下降趨勢，考慮可能由于正常骨髓造血功能儲備比較強大，鐵過載對正常骨髓功能的損傷不足以引起外周血象的顯著改變。這與臨床原發(fā)性鐵過載患者的臨床表現(xiàn)類似，而與繼發(fā)性鐵過載患者的臨床表現(xiàn)存在一定差異。

綜上，本研究通過給小鼠腹腔注射右旋糖酐鐵成功建立鐵過載模型，但是由于正常骨髓強大的代償功能，雖然鐵過載對骨髓造血集落有較明顯的影響，而該影響不足以引起外周血象的改變。這現(xiàn)象與臨床上原發(fā)性鐵過載患者的情況基本符合，為以后深入研究鐵過載發(fā)病的機制研究提供實驗模型。

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