孫勤國 江 波 崔曉燕 張賢梅 徐鴻婕

武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430060

·實驗研究·

口瘍清方對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍模型大鼠免疫功能的研究*

孫勤國 江 波 崔曉燕 張賢梅 徐鴻婕

武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430060

目的研究口瘍清方對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer，ROU)模型大鼠免疫功能的影響，探討該方對ROU的預(yù)防和治療作用。方法①用免疫法建立大鼠ROU模型，并用口瘍清方行早期預(yù)防和模型成功后治療；②用流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測各組大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞比例。結(jié)果模型大鼠CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞均下降，而口瘍清方的早期預(yù)防和后期治療均可以明顯提高相應(yīng)的比例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論口瘍清方可以解除ROU的免疫抑制狀態(tài)，增強模型大鼠的免疫功能，對ROU具有防治作用。

口瘍清方； 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍； 流式細胞術(shù)； T細胞亞群

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer，ROU)又稱復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍(recurrent aphthous ulcer，RAU)或復(fù)發(fā)性阿弗他口炎(recurrent aphthous stomatitis，RAS)，是一種好發(fā)于唇、舌、頰、軟腭等部位，具有周期性、復(fù)發(fā)性、自限性特征的口腔黏膜疾病[1]。ROU發(fā)病機制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)遷延難愈，目前尚無特殊藥物治愈。中醫(yī)“未病先防，既病防變”思想為ROU預(yù)防和治療提供思路，本研究擬探討口瘍清方對ROU的預(yù)防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF級雄性SD大鼠22只，體重180～200 g，購買于武漢大學(xué)動物實驗中心[SCXK(鄂)：2008-0004]，喂養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動物中心。

1.2 主要試劑和儀器

口瘍清方(當(dāng)歸12 g，生地、丹皮、紫草、藿香各10 g，升麻、黃連、甘草各6 g)由本科自擬，藥劑科煎制。PITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8單克隆抗體(聯(lián)科生物)；紅細胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；流式細胞儀(美國DB公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 ROU模型的制備及分組 將購買的大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，無菌條件下取口腔黏膜，PBS勻漿后，與完全弗氏佐劑按1∶1的比例制備成抗原乳化劑，用玻璃棒攪勻約20 min，直至滴入水中1 min內(nèi)不散開。將制備好的抗原乳化劑注射SD大鼠背部，注射時先用剪刀剪去被毛，用75%酒精消毒注射部位皮膚，每次注射2～3個點，每點注射0.1 ml，每周1次，連續(xù)7周。模型的建立與成功標準參考文獻[2-3]。

隨機分組：正常對照組5只，正常飲食，不給予任何藥物；模型組5只，建模成功后不給予任何藥物干預(yù)；預(yù)防組6只，自第1次免疫注射時就給予口瘍清方，按照人與大鼠的比例計算，每天4.2 g/kg灌胃預(yù)防給藥，直至處死取材；治療組6只，建模成功后給藥，每天4.2 g/kg灌胃治療給藥。各組大鼠藥物干預(yù)15 d后，用10%的水合氯醛麻醉后取眼眶后靜脈血。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測外周血T細胞亞群 標記高壓滅菌離心管，分別取100 μl抗凝外周血，各管先后分別加入10 μl PITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8三種染色試劑。另外取3管正常組抗凝血100 μl分別加入PITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8，取1管正常組抗凝血不加入任何抗體標記，作對照和設(shè)門參照，每管10 μl，37 ℃孵育30 min，取出后每管加入1.5 ml紅細胞裂解液，室溫下孵育45 min后，3 min，1 200 rpm離心，倒掉上清液，再用PBS清洗2～3次，直至離心管內(nèi)為透明色，最后用500 μl PBS重懸，過濾后上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

實驗期間大鼠飲食無明顯變化規(guī)律，免疫注射后大鼠精神狀態(tài)及活動較正常組稍差，抓取時易于反抗。每次注射后第3天注射點開始出現(xiàn)潰瘍，大小不均，最大達0.8～1.0 cm，注射點有相互融合現(xiàn)象，潰瘍愈合后形成疤痕，第3次免疫注射后牙齦和口腔黏膜開始出現(xiàn)充血，第4次注射后下牙齦出現(xiàn)紅黃相間的黏膜改變，有接觸性出血，于第6次注射后出現(xiàn)潰瘍，大小、部位不一；口瘍清方治療后，潰瘍面面積縮小，部分潰瘍點消失，口腔黏膜紅潤。見圖1。

A：第4次免疫注射時大鼠背部潰瘍改變；B：第6次注射后口腔黏膜變化(模型)；C：口瘍清方干預(yù)后口腔黏膜變化

2.2 流式細胞術(shù)檢測T細胞亞群的比例

建模后外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞均有所下降，真正代表輔助/誘導(dǎo)性T淋巴細胞CD3+CD4+和真正代表CD8+T淋巴細胞的CD3+CD8+下降幅度較混有單核細胞、NK及少許粒細胞的CD4+、CD8+稍低，且CD3+CD4+/ CD3+CD8+較正常組低，說明免疫法建立的ROU大鼠模型免疫功能存在抑制狀態(tài)。通過口瘍清方的早期預(yù)防和后期治療可以明顯改善這種抑制狀態(tài)，兩組總體T淋巴細胞較模型組有明顯上升(P= 0.012，0.049)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。說明口瘍清方可以在一定程度上解除由免疫佐劑制備的口腔黏膜蛋白抗原誘導(dǎo)的免疫損傷，促進口腔黏膜的愈合，對ROU有預(yù)防和治療作用。見表1。

3 討論

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍中醫(yī)稱“口瘡”、“口疳”、“口糜”等，主要因飲食厚味、勞倦內(nèi)傷、情志失調(diào)等導(dǎo)致上焦實火熏灼、下焦陰火上炎、中焦虛寒或脾虛濕困等引起。清朝齊秉惠《齊氏醫(yī)案·口瘡》認為：“口瘡上焦實熱，中焦虛寒，下焦陰火，各經(jīng)傳遍所致，當(dāng)分辨陰陽虛實寒熱而治之”。孔燕[4]則從臟腑論治該病，認為心火上炎證用瀉心導(dǎo)赤散加減，心脾積熱證用清熱瀉脾散加減，肝郁化火證用龍膽瀉肝湯加減，肝郁脾虛證用逍遙散或丹梔逍遙散加減，肺胃蘊熱證用枇杷清肺飲加減，脾胃濕熱證用茵陳蒿湯合三仁湯加減，脾胃氣虛證用補中益氣湯加味，陰虛火旺證用知柏地黃丸加減，脾腎陽虛證用附子理中丸加減。

表1 流式檢測T細胞亞群比例

與模型組比較*Plt;0.05

口瘍清方以當(dāng)歸、生地為君藥，補血養(yǎng)陰生津，以黃連、丹皮、紫草為臣藥，清氣、血分虛實之熱，佐以藿香化濕，使以甘草調(diào)和諸藥，并以升麻引藥上行，升清降濁，全方養(yǎng)陰清熱，瀉火解毒，兼顧化濕，使?jié)駸嶂暗靡郧迳ⅲ尻柕靡陨e。方劑中藥用成分早前已有研究[5-6]認為，當(dāng)歸中當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸免疫促進功能的主要成分，能促進小鼠非特異性免疫反應(yīng)，顯著促進免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬能力，并主要促進細胞免疫?，F(xiàn)代研究[7-9]認為，當(dāng)歸內(nèi)酯對小鼠的免疫功能有一定的重構(gòu)作用，當(dāng)歸多糖和生地也能明顯促進外周血T 淋巴細胞增殖。

T細胞是淋巴細胞的主要組分，它具有多種生物學(xué)功能，T細胞的細胞免疫作用可釋放多種淋巴因子，最終使機體免疫效應(yīng)增強。CD3、CD4、CD8 是T細胞膜表面特異性抗原，CD3+代表全T淋巴細胞，它包括T輔助/誘導(dǎo)T細胞(CD4+)和T抑制/細胞毒T細胞(CD8+)，CD3+CD4+代表 T輔助/誘導(dǎo)細胞亞群，CD3+CD8+代表 T抑制/細胞毒性細胞亞群，CD3+CD4+/ CD3+CD8+代表 T輔助細胞/T抑制細胞的比值，通過測定各個比例可以反應(yīng)機體的免疫功能狀態(tài)[10]。本實驗采用免疫法建立ROU大鼠模型，研究口瘍清方對ROU大鼠模型早期預(yù)防及潰瘍期形成后的治療作用。以流式細胞術(shù)檢測外周血T細胞亞群統(tǒng)計結(jié)果分析，認為模型組比正常組的CD3+、CD4+、CD3+CD4+/ CD3+CD8+均有減少，這與之前關(guān)于ROU免疫功能異常的研究結(jié)果是一致的[2-3]，口腔潰瘍出現(xiàn)的時間較參考模型晚，分析可能與免疫佐劑中卡介苗的含量有關(guān)，結(jié)果還顯示，前期預(yù)防組和后期治療組的相應(yīng)比例增加，說明口瘍清對ROU模型大鼠的免疫抑制解除有一定的作用?？诏兦宸綄OU模型大鼠具有防治作用，但其具體免疫途徑及分子機制有待于進一步深入研究。

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EffectofKouYangqingPrescriptionontheImmunologicFunctionofRatswithRecurrentOralUlcer

SUN Qinguo,JIANG Bo,CUI Xiaoyan,et al

DepartmentofTraditionalChineseMedicine,WuhanNo.3Hospital,Wuhan430060,China

ObjectiveTo study the effect of Kou Yangqing prescription on the immunologic function of rats with recurrent oral ulcer.Methods①Using immune method to establish ROU rats model，and using Kou Yangqing prescription to early prevent and treat after the model successfully made ;②Using FCM to detect the peripheral blood level of CD3+，CD4+，CD8+T lymphocytes in each group.ResultsThe CD3+、CD4+、CD8+of T lymphocytes in model group has declined as compared with the control group，however，the early prevention and post-treatment can significantly improve the corresponding proportion of T lymphocytes(Plt;0.05).ConclusionThe Kou Yangqing prescription can relieve the immunosuppressive state and enhance the immune function of rats with ROU.

Kou Yangqing prescription；ROU； FCM；T cell subpopulation

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.02.004

*武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學(xué)科研項目(No.WZ12A02)

2013-02-11)