徐 嘉， 徐 雪， 王中華， 胡旭初， 詹 蔚， 葉 子， 詹 紅， 熊 艷△

(中山大學1附屬第一醫(yī)院急診科，2附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)神經三科，3中山醫(yī)學院寄生蟲教研室，廣東廣州510080)

巨噬細胞是參加機體針對感染和炎癥的天然免疫應答的重要細胞，主要參與吞噬病原體、免疫調理和組織損傷的病理生理過程。這些作用被認為是經典活化型巨噬細胞(classical activated macrophage，M1)的主要功能。但近年來，一種新的巨噬細胞亞類越來越受到重視，其活化條件和功能狀態(tài)與經典活化型巨噬細胞大不相同，被稱為替代活化型巨噬細胞(alternatively activated macrophage，M2)，主要參與抑制炎癥、免疫耐受和損傷修復的病理生理過程。慢性華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis，Cs)感染可導致宿主機體免疫應答向Th2方向偏移，產生抑制炎癥反應的細胞因子、效應分子和T細胞亞型等，慢性華支睪吸蟲感染的宿主機體對可能同時存在的急性炎癥反應表現出抑制免疫應答，減輕組織損傷的效應，但其中的具體機制尚不明確。本研究通過建立慢性華支睪吸蟲感染大鼠模型，檢測血清促炎和抗炎因子水平以評價其免疫狀態(tài)，并觀察不同狀態(tài)下腹腔巨噬細胞的表型分化以及對炎癥刺激因子的反應，探討Cs感染對其它感染性疾病的影響及可能的機制。

材料和方法

1 動物及分組

清潔級雄性SD大鼠(160～180 g)40只，購自中山大學北校區(qū)實驗動物中心，其中正常對照組10只，慢性華支睪吸蟲感染組10只，進行第一部分實驗。余20只同樣分組，用于獲取腹腔巨噬細胞進行第二部分實驗。感染華支睪吸蟲囊蚴的麥穗魚取自中山醫(yī)學院寄生蟲實驗室建造的生態(tài)池。

2 主要試劑和儀器

高糖型 DMEM、RPMI-1640、DPBS和不含 Ca2+、Mg2+的HBSS均購自Gibco;胰酶和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購于Sigma;大鼠腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)、白細胞介素 4(interleukin 4，IL-4)和 IL-10的ELISA檢測試劑盒購于Bender MedSystems;抗大鼠PE-Cy5F4/80和大鼠PE-CD16/32抗體購于eBioscience;大鼠FITC-CD206抗體購于Santa Cruz;氯化鈉、氯化鉀等為國產分析純;消化液由中山醫(yī)學院寄生蟲教研室保存;微量移液器購于Gilson;15 mL離心管、50 mL培養(yǎng)瓶和96孔培養(yǎng)板購于Corning;測試儀器包括Bio-Rad公司的MODEL 550型酶標儀;北京醫(yī)用離心機廠生產的臺式離心機;BD公司的FACSCalibur流式細胞儀。

3 方法

3.1 建立慢性華支睪吸蟲感染模型

3.1.1 華支睪吸蟲囊蚴的收集 (1)麥穗魚肉50 g，用絞肉機絞碎;(2)碎魚肉放入2 000 mL的大燒杯中，加入自來水少量，攪勻，再加自來水至滿，充分攪勻，靜置15 min，倒去上液，余下一半體積的液體;(3)把消化液加入燒杯中，攪勻，放入37℃溫箱中消化，每隔20～30 min攪拌1次，約經4～12 h，即可消化完全;(4)將消化好的魚肉從溫箱中取出，靜置15 min，倒去上液，余下的用80目篩網過濾，把殘渣過濾掉;(5)濾液中加入生理鹽水，靜置30 min，倒去上液，如此反復，直至上液澄清為止，換到小平皿中，沉淀在解剖鏡下挑取活囊蚴。

3.1.2 囊蚴攻擊感染SD大鼠致華支睪吸蟲慢性感染模型 具體操作如下:對華支睪吸蟲感染組大鼠進行囊蚴感染，采用灌胃針經口灌胃，每只SD大鼠50個囊蚴，感染后第20 d開始每天收集糞便查蟲卵，確定最早排蟲卵時間，感染后第70 d收集大鼠糞便檢出蟲卵證實感染模型建造成功。

3.2 腹腔巨噬細胞的收集 取細胞前SD大鼠禁食不禁水24 h;SD大鼠乙醚麻醉后，斷頭處死。將動物仰臥放置，剪去腹壁皮毛，用70%乙醇消毒;沿正中線剪開腹壁，將5～10 mL沖洗液注入腹腔，用吸管反復沖洗腹膜腔;將腹膜腔的細胞懸液吸入離心管，室溫離心(1 000 r·min-1，10 min，2 次);用培養(yǎng)液混懸沉淀細胞，將細胞加入培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)2 h;吸去培養(yǎng)液，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次，除去漂浮的細胞，得到附著于培養(yǎng)瓶底壁的巨噬細胞。

3.3 腹腔巨噬細胞體外實驗分組及處理 按照腹腔巨噬細胞的大鼠來源，分為3組:對照組(control group)、正常大鼠巨噬細胞組(normal group)和華支睪吸蟲感染大鼠巨噬細胞(Cs infestation group)組。采用酶消化法取出貼壁的巨噬細胞，室溫離心(1 000 r·min－1，10 min)，用無色 RPMI-1640 完全培養(yǎng)液混懸沉淀細胞，將細胞調整至2×109/L，接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，1 d后培養(yǎng)基換為無色RPMI-1640不完全培養(yǎng)液。其中正常巨噬細胞組和肝吸蟲感染巨噬細胞組加入LPS(10 μg/L)刺激孵育，對照組加入無色RPMI-1640培養(yǎng)，每組每個時點做3個平行孔。在刺激后的0、2、12、24 h收集各組各孔細胞培養(yǎng)上清液，－80℃保存。

3.4 流式細胞術檢測細胞膜蛋白表達 采用酶消化法取得貼壁的腹腔巨噬細胞，調整細胞至每管5×105細胞，PBS 洗1 次，100 μL PBS 重懸，向巨噬細胞中加入抗大鼠PE-Cy5F4/80抗體，向經誘導刺激后的巨噬細胞中加入小鼠FITC-CD206抗體和小鼠PECD16/32抗體，避光室溫孵育30 min，PBS洗3遍，再用PBS 200 μL重懸后用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測。

3.5 細胞因子的檢測 采用ELISA法檢測各組大鼠血清的 IL-4、IL-10、TNF-α 和 IFN-γ 濃度，以及各組各時點巨噬細胞培養(yǎng)上清液TNF-α濃度，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數據采用SPSS 16.0軟件處理，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組計量資料比較采用t檢驗，兩組以上計量資料比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 正常大鼠與慢性華支睪吸蟲感染大鼠血清細胞因子的比較

慢性Cs感染組較正常對照組血清IL-4、IL-10、TNF-α 和IFN-γ均明顯升高(P ＜0.05)，其中IL-4和IL-10的升高更加顯著，見表1。

表1 正常對照組和慢性Cs感染組大鼠血清細胞因子濃度的比較Table 1.Comparison of serum levels of IL-4，IL-10，TNF-α and IFN-γ in rats from normal group and chronic Cs infestation group(ng/L.Mean± SD.n=10)

2 正常對照組與慢性華支睪吸蟲感染組的腹腔巨噬細胞分化情況

流式細胞儀檢測結果顯示正常對照組大鼠的腹腔巨噬細胞向M1型巨噬細胞分化的比例為92.11%，見圖1A，而慢性華支睪吸蟲感染組大鼠的腹腔巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化的比例為93.84%，見圖1B。

Figure 1.The differentiation proportion of different types of peritoneal macrophages from normal group(A)and chronic Cs infestation group(B).圖1 正常對照組與慢性肝吸蟲感染組腹腔不同類型巨噬細胞的分化情況

3 空白對照組、正常對照組和慢性Cs感染組大鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清液TNF-α和IL-10濃度的比較

在未受LPS刺激時，空白對照組、正常對照組和慢性Cs感染組大鼠巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的濃度均較低，基礎值比較無顯著差異(P ＞0.05);給予LPS(10 μg/L)刺激后的2、12 和24 h，正常對照組和慢性Cs感染組腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清液TNF-α和IL-10濃度均呈時間依賴性升高，其中正常對照組腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清液TNF-α濃度上升更顯著(P＜0.05)，而慢性Cs感染組腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清液IL-10的濃度上升更加顯著(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠不同時點腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)上清液TNF-α和IL-10水平的比較Table 2.The levels of TNF-α and IL-10 in the culture supernatants of peritoneal macrophages at different time points in the three groups(ng/L.Mean ±SD.n=10)

討 論

Cs又稱為肝吸蟲，是感染人類引起華支睪吸蟲病的病原體，其感染在世界范圍內流行，且具有慢性化和長時程的特點［1］。與其它蠕蟲感染一樣，華支睪吸蟲感染會引起宿主的免疫反應，而蠕蟲感染與宿主免疫應答的關系一直是病原生物學領域研究的熱點，主要集中于探討宿主免疫應答在Cs致病機制中的作用［2］。Cs感染可誘導宿主機體獲得性免疫向Th2方向極化，產生大量的Th2應答的細胞因子，如IL-4、IL-5 和 IL-13 等［3］，這些細胞因子可以打擊感染的蠕蟲，但同時蠕蟲可以通過誘導產生抗炎因子IL-10和轉化生長因子 β(transfer growth factor β，TGF-β)逃避宿主機體的免疫攻擊，在宿主體內長期生存，這就是Cs感染呈慢性過程的主要機制［4］。除此之外，關于蠕蟲感染引起的宿主免疫應答的極化對其它疾病影響的研究越來越受到學者們的關注，已有研究顯示，慢性蠕蟲感染對感染性疾病，如細菌、病毒等具有保護效應［5］，但具體的機制尚不明確。

巨噬細胞是機體免疫應答，尤其是在對抗病原體感染機體的天然免疫應答過程中的重要細胞之一，巨噬細胞在不同的刺激條件下發(fā)生不同的功能變化，參與感染、炎癥等多種病理生理過程［6］。根據巨噬細胞活化狀態(tài)和發(fā)揮作用的不同，分為經典活化型巨噬細胞(M1型)和替代活化型巨噬細胞(M2型)［7］，它們在體內和體外均具有較強的可塑性，在不同條件下向不同方向極化［8］。其中，在Th2型細胞因子的作用下，如IL-4或IL-13等，巨噬細胞向M2型分化，與M1型巨噬細胞吞噬病原體、激發(fā)炎癥反應和組織損傷的作用不同，M2型巨噬細胞主要發(fā)揮減輕炎癥反應、組織修復和血管生成的生物學作用［9］，以往血吸蟲感染的研究顯示M2巨噬細胞主要通過表達精氨酸酶1(Arg-1)和抵抗素樣分子 α(RELMα)等發(fā)揮對炎癥的抑制作用［10-11］。巨噬細胞缺乏表達Arg-1的小鼠不能抑制血吸蟲蟲卵誘導的炎癥［11］。因此，M2巨噬細胞的免疫抑制效應可能并不完全依賴Th2細胞因子機制，有研究表明其抗炎和免疫調節(jié)機制也不依賴于IL-10［12］，具體機制需進一步研究。

我們在以往的研究中，通過囊蚴灌胃建立了慢性Cs感染大鼠的模型，并通過改變灌胃囊蚴的數量、頻次以及感染時間的摸索，確定最佳的建模條件，檢測大鼠血清的抗體以 IgE和 IgG1亞類為主［13］。本實驗中，慢性Cs感染大鼠血清的IL-4和IL-10等抑炎因子明顯升高，為誘導腹腔巨噬細胞向M2表型分化提供了免疫環(huán)境，流式細胞學檢測腹腔巨噬細胞表面標志物證實慢性Cs感染后腹腔巨噬細胞向M2型極化，而在自然狀態(tài)下正常對照的大鼠腹腔巨噬細胞仍以經典的M1型為主。體外以脂多糖刺激并培養(yǎng)不同類型的腹腔巨噬細胞，以觀察不同巨噬細胞對LPS這種革蘭陰性細菌感染致膿毒癥的最重要致病因子的炎癥應答，檢測細胞培養(yǎng)上清液TNF-α的濃度，結果顯示，LPS刺激后 M1和M2型巨噬細胞均可對LPS刺激反應，培養(yǎng)上清液TNF-α和IL-10濃度隨時間進行性升高，從LPS刺激2 h開始各時點測得M2型巨噬細胞培養(yǎng)上清液的TNF-α水平較M1巨噬細胞明顯降低，相反的，另一種抑炎因子IL-10的水平隨時間進展明顯升高，這反映出M2巨噬細胞對炎癥刺激的耐受。在我們關注的膿毒癥研究中，以往免疫調節(jié)治療的研究往往局限于某些藥物或免疫系統(tǒng)的某個環(huán)節(jié)［14］，本研究初步結果顯示在慢性Cs感染導致的機體Th2免疫應答環(huán)境下，發(fā)生了參與炎癥反應關鍵的巨噬細胞和細胞因子的改變，這可能為臨床嚴重感染所致膿毒癥的疾病診治提供了新的思路和理論基礎，相關的實驗研究已經深入展開。

［1］ Rim HJ.Clonorchiasis:an update［J］.J Helminthol，2005，79(3):269-281.

［2］ 高 翔，劉 平，李懿宏，等.華支睪吸蟲感染患者血清Th1/Th2細胞因子水平檢測及意義［J］.國際免疫學雜志，2006，29(1):55-57.

［3］ Maizels RM，Yazdanbakhsh M.Immune regulation by helminth parasites:cellular and molecular mechanisms［J］.Nat Rev Immunol，2003，3(9):733-744.

［4］ Taylor A，Verhagen J，Blaser K，et al.Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-β:the role of T regulatory cells［J］.Immunology，2006，117(4):433-442.

［5］ Van Riet E，Hartgers FC，Yazadanbakhsh M.Chronic helminth infections induce immunomodulation:consequences and mechanisms［J］.Immunobiology，2007，212(6):475-490.

［6］ 吳曉倩，宜 金，何麗珊.ox-LDL對巨噬細胞內皮脂肪酶表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(7):1172-1175.

［7］ Mantovani A，Sica A，Locati M.Macrophage polarization comes of age［J］.Immunity，2005，23(4):344-346.

［8］ Gordon S.Macrophage heterogeneity and tissue lipids［J］.J Clin Invest，2007，117(1):89-93.

［9］ Edward JP，Zhang X，Frauwirth KA，et al.Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations［J］.J Leukoc Biol，2006，80(6):1298-1307.

［10］ Pesce JT，Ramalingam TR，Mentink-Kane MM，et al.Arginase-1-expressing macrophages suppress Th2 cytokine-driven inflammation and fibrosis［J］.PLoS Pathog，2009，5(4):e1000371.

［11］ Nair MG，Du Y，Perrigoue JG，et al.Alternatively activated macrophage-derived RELM-α is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung［J］.J Exp Med，2009，206(4):937-952.

［12］ Herbert DR，Holscher C，Mohrs M，et al.Alternative macrophage activation is essential for surviving during schistosomiasis and downmodulated T helper 1 responses and immunopathology［J］.Immunity，2004，20(3):623-635.

［13］ Wang X，Liang C，Chen W，et al.Experimental model in rats for study on transmission dynamics and evaluation of Clonorchis sinensis infection immunologically，morphologically，and pathologically［J］.Parasitol Res，2009，106(1):15-21.

［14］ 黃順偉，管向東，陳 娟，等.烏司他丁聯(lián)合胸腺肽α1改善膿毒癥患者免疫功能的作用機制研究［J］.中國病理生理雜志，2009，25(11):2168-2172.