劉 偉，孫裕強(qiáng)，孫 寧，劉 志

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，遼寧沈陽(yáng)110001)

早期液體復(fù)蘇是救治膿毒性休克的重要和必要手段，雖然有臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道早期液體復(fù)蘇能改善膿毒性休克合并急性肺損傷(acute lung injury，ALI)患者的預(yù)后［1-2］，但也有研究稱大量補(bǔ)液可使液體在組織間隙潴留而加重休克患者的肺損傷［3-4］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，早期液體復(fù)蘇與氫氣吸入作為聯(lián)合干預(yù)手段，可以減少?gòu)?fù)蘇所需要的液體量，減輕肺水腫和肺臟的氧化還原損傷［5］。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究這種聯(lián)合干預(yù)方法對(duì)膿毒性休克大鼠肺臟凋亡蛋白及炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 大鼠隨機(jī)分成4組，正常對(duì)照組(A組，n=15)、膿毒性休克對(duì)照組(B組，n=15)、早期液體復(fù)蘇組(C組，n=15)和早期液體復(fù)蘇+2%氫氣吸入組(D組，n=15)。所有動(dòng)物均為健康雄性Wistar大鼠(180～200 g)，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，并在清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)繁殖。

1.2 主要儀器 HX300動(dòng)物呼吸機(jī)，HP便攜式心電監(jiān)護(hù)儀，OMNI血?dú)夥治鰞x(瑞士 AVL公司)，Trans-Blot轉(zhuǎn)印儀 (Bio-Rad)，光學(xué)顯微鏡(Olympus)。

1.3 主要試劑 脂多糖［lipopolysaccharides，LPS;Sigma(L-2880);from E.coli serotype O55:B5］，白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、IL-8和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗鼠Fas及Bcl-2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，PVDF膜 (Millipore)，ECL reagents(GE healthcare)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制作 10%水合氯醛(300 mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉，氣管切開(kāi)接呼吸機(jī)輔助通氣，呼吸頻率100 min－1，潮氣量10 mL/kg，D組吸入氣體為2%氫空混合氣，其余3組吸入氣體為空氣。左頸動(dòng)脈穿刺，連接監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)心率及平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP);股靜脈穿刺留置導(dǎo)管，以備給藥及補(bǔ)液，電熱器維持體溫。大鼠狀態(tài)穩(wěn)定30 min后，除A組外，其余3組LPS 15 mg/kg(配制濃度10 g/L，推注時(shí)間不少于2 min，推注完畢再推入0.2 mL生理鹽水將注射器內(nèi)殘存的LPS完全注入)緩慢靜脈注射，建立膿毒性休克大鼠模型［6］，A組靜脈注入等量生理鹽水。液體復(fù)蘇方案:生理鹽水10 mL/kg/15 min，30 min后根據(jù)MAP水平，應(yīng)用去甲腎上腺素(0.5 ～ 6 μg·kg－1·min－1)，維持 MAP 于正常水平［6］。記錄各組的生命體征、補(bǔ)液量及去甲腎上腺素的用量。

所有大鼠于模型建立成功2 h后經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死，留取動(dòng)脈血1 mL行血?dú)夥治?開(kāi)胸取出心肺，剪下右肺背后葉，切取0.1 cm ×0.1 cm ×0.1 cm 組織多塊，一塊4℃ 4%多聚甲醛固定，行石蠟包埋、切片，留作HE染色及免疫組化，一塊－70℃保存，留作Western blotting測(cè)定;右肺門(mén)結(jié)扎，用2 mL生理鹽水對(duì)左肺進(jìn)行反復(fù)肺泡灌洗3次，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)回收量 3.0～3.6 mL，將 BALF 離心(1 500 ×g、4 min)，上清液－20℃保存，留作檢測(cè)炎癥介質(zhì)表達(dá)。

2.2 免疫組化檢測(cè)肺臟組織中Fas及Bcl-2表達(dá)所有標(biāo)本均經(jīng)40 g/L甲醛固定，石蠟包埋組織連續(xù)切片(厚4 μm)，每例標(biāo)本分別做常規(guī)HE和免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)SP法分別標(biāo)記Fas及Bcl-2，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DAB顯色，蘇木素復(fù)染核。PBS代替第I抗體作為陰性對(duì)照，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.3 Western blotting檢測(cè)肺組織中Fas及Bcl-2蛋白表達(dá) 每組蛋白上樣量均為10 μg，采 12.5%SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，采用Trans-Blot轉(zhuǎn)印儀，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，然后加入相抗體，通過(guò)ECL試劑檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物。采用Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析。

2.4 BALF中炎癥介質(zhì)檢測(cè) 將凍存的BALF在冰上解凍，1 000×g 4℃離心15 min，ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8和TNF-α水平(嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺組織HE染色結(jié)果

光鏡下觀察HE染色肺組織切片，A組肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯充血、中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)和間質(zhì)水腫，見(jiàn)圖1A;B組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁完整性破壞，伴有肺泡壁增厚、水腫，肺泡腔內(nèi)大量中性粒細(xì)胞聚集，肺泡毛細(xì)血管充血滲出，肺泡腔內(nèi)出血，部分肺泡萎陷，見(jiàn)圖1B;C組肺泡腔內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集較B組明顯減少，肺泡毛細(xì)血管滲出亦有所減輕，但肺泡壁水腫未見(jiàn)明顯改善，見(jiàn)圖1C;D組肺泡損傷情況較B組明顯減輕，肺泡壁充血水腫較C組明顯緩解，見(jiàn)圖1D。

Figure 1.HE staining of pulmoary tissues in A，B，C and D groups(×200).圖1 肺組織病理變化

2 肺組織中Fas及Bcl-2免疫組化表達(dá)結(jié)果

免疫組化染色檢測(cè)Fas及Bcl-2表達(dá)，2種蛋白表達(dá)陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色，主要位于細(xì)胞漿中，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞為支氣管黏膜上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，正常肺組織各蛋白均有基礎(chǔ)低表達(dá)，見(jiàn)圖2。B組Fas表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2表達(dá)減弱;C組與B組比較，F(xiàn)as表達(dá)減弱，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05);D組與C組比較，F(xiàn)as表達(dá)進(jìn)一步減弱，Bcl-2表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。

Figure 2.Expression of Fas and Bcl-2 in pulmonary tissues in A，B，C and D groups(immunohistochemical staining，×400).圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺組織Fas及Bcl-2的表達(dá)

表1 各組間Fas及Bcl-2平均吸光度和陽(yáng)性面積率比較Table 1.The absorbance and positive rates of area of Fas and Bcl-2 in different groups(mean±SD.n=15)

3 Western blotting檢測(cè)肺組織中Fas及Bcl-2蛋白的表達(dá)

正常肺組織各蛋白均有基礎(chǔ)低表達(dá)，與A組相比，B組Fas表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)，Bcl-2表達(dá)明顯減弱(P＜0.01);C組與B組比較，F(xiàn)as表達(dá)明顯減弱(P＜0.01)，Bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05);D組與C組比較，F(xiàn)as表達(dá)明顯減弱(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Western blotting results of Fas and Bcl-2 expression in pulmonary tissues in A，B，C and D groups.Mean ± SD.n=15.＊＊P ＜0.01 vs A group;△△P ＜0.01 vs B group;#P ＜0.05 vs C group.圖3 Western blotting檢測(cè)肺組織Fas及Bcl-2蛋白的表達(dá)

4 BALF中炎癥介質(zhì)表達(dá)

B組BALF中 IL-6、IL-8、TNF-α水平較 A 組明顯升高(P＜0.05);C組與B組比較促炎介質(zhì)水平降低(P＜0.05);D組與C組比較進(jìn)一步降低了促炎介質(zhì)水平(P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組BALF中炎性介質(zhì)的水平Table 2.Levels of inflammatory mediators in BALF(ng/L.Mean±SD.n=15)

討 論

膿毒性休克和急性肺損傷是危重癥患者的主要死亡原因，失控和放大的炎癥反應(yīng)是膿毒癥和ALI的重要發(fā)病機(jī)制之一［7］，本研究結(jié)果顯示膿毒性休克導(dǎo)致ALI過(guò)程中肺泡灌洗液中促炎介質(zhì)IL-6、IL-8、TNF-α水平較正常對(duì)照組明顯升高。

一直以來(lái)氫分子被認(rèn)為是一種惰性氣體，在潛水醫(yī)學(xué)領(lǐng)域高壓氫被作為一種潛水技術(shù)。但最近研究證實(shí)低濃度氫可以選擇性中和羥自由基，而后者是氧化損傷的最重要介質(zhì)，目前體內(nèi)尚未找到特異性清除途徑，動(dòng)物呼吸2%的氫氣就可有效清除自由基，顯著改善腦缺血－再灌注損傷［8］，隨后多項(xiàng)研究證實(shí)在缺血－再灌注損傷、炎性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)性疾病等動(dòng)物模型中，氫分子都顯示了較好的治療效果［9-12］。目前氫分子在膿毒癥領(lǐng)域研究甚少，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，早期液體復(fù)蘇與氫氣吸入作為聯(lián)合干預(yù)手段，可以減少?gòu)?fù)蘇所需要的液體量，減輕肺水腫和肺臟的氧化還原損傷［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提示聯(lián)合氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案比單純液體復(fù)蘇更能降低肺泡灌洗液中促炎介質(zhì)(IL-6、IL-8和TNF-α)表達(dá)水平，從而從減輕過(guò)度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肺損傷方面保護(hù)肺功能。

肺泡上皮細(xì)胞凋亡是ALI發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制［13］。肺泡上皮一旦受損，就會(huì)出現(xiàn)跨上皮液體運(yùn)輸及肺泡水腫液再吸收障礙，液體平衡將會(huì)迅速遭到破壞，導(dǎo)致肺水腫及肺功能障礙［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)，死亡受體通路中Fas-FasL與ALI/ARDS肺泡上皮細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。內(nèi)毒素誘發(fā)肺損傷時(shí)，肺內(nèi)上皮細(xì)胞Fas表達(dá)增加，阻斷Fas系統(tǒng)可減輕內(nèi)毒素引發(fā)的肺損傷［16］。Bcl-2被認(rèn)為是最重要的抗凋亡因子，能抑制許多因素誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞存活、凋亡和壞死的關(guān)鍵調(diào)控因子，是公認(rèn)的細(xì)胞保護(hù)因子［17-18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膿毒性休克對(duì)照組肺組織中Fas表達(dá)增加而B(niǎo)cl-2表達(dá)減少，提示Fas和Bcl-2參與了膿毒性休克致ALI中肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致了ALI的發(fā)生及發(fā)展。單純液體復(fù)蘇使肺臟細(xì)胞凋亡程度下降，表現(xiàn)為Fas表達(dá)減少而B(niǎo)cl-2表達(dá)升高，聯(lián)合氫氣吸入后上述凋亡情況進(jìn)一步改善，提示氫氣吸入可以降低肺組織中Fas表達(dá)、提高Bcl-2表達(dá)，從而減輕了肺組織細(xì)胞凋亡程度，抑制凋亡所致急性肺損傷，進(jìn)一步保護(hù)肺功能。

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