鄭嬌嬌， 吳清明， 陳建華， 陳彩虹， 龍 輝

(1武漢科技大學(xué)，2武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院，3武漢凱泰新生物技術(shù)有限公司，湖北武漢430064)

放射治療是目前食管癌的主要治療手段，但療效欠佳，有研究發(fā)現(xiàn)放射治療的效果不佳與食管癌干細(xì)胞的放射抗拒有關(guān)［1］，近來同時有研究認(rèn)為p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)有可能成為食管癌干細(xì)胞特異性標(biāo)志［2］。P162(安疴利肽)是基于Ras-GTP酶激活蛋白SH3功能區(qū)結(jié)合蛋白(Ras-GTPase-activating protein SH3 domain-binding protein，G3BP)靶標(biāo)、利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計方法篩選獲得的全新抗癌多肽(中國專利201010140032.3，PCTWO2011/124063 A1)，前期已證實(shí)該藥對G3BP高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116有明顯抑制作用及化療增敏作用［3］。本實(shí)驗以食管癌細(xì)胞株Eca109為對象，觀察P162是否對Eca109細(xì)胞具有放射增敏作用及P162是否抑制食管癌干細(xì)胞。此項研究在國內(nèi)外尚屬首次。

材料和方法

1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器

人食管癌細(xì)胞株Eca109(由太和醫(yī)院饋贈);G3BP抗體(Bioss);P162(武漢凱泰新生物技術(shù)有限公司)溶解于無菌水中，－20℃冰箱保存;RPMI-1640培養(yǎng)粉(Gibco)，新生胎牛血清(杭州四季青有限公司)，胰蛋白酶粉(Amresco)，CCK-8(cell counting kit-8)試劑(Sigma)，PE標(biāo)記的鼠抗人 p75NTR(CD271)抗體(BD)，吉姆薩染液(Amresco)。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force)，倒置顯微鏡(Olympus)，超凈工作臺(蘇州凈化)，ELx800酶聯(lián)免疫檢測儀(BioTek)，超速低溫離心機(jī)(Sigma)，流式細(xì)胞儀和FC 500 cytometers CXP分析軟件(Beckman Coulter)，37℃恒溫水浴箱(華普達(dá)公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Eca-109細(xì)胞用含有10%胎牛血清、青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長的速度及培養(yǎng)基的顏色更換培養(yǎng)基，一般為1～2 d換1次，用0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)，選對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

2.2 細(xì)胞免疫化學(xué) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按5×107/L的細(xì)胞密度接種于6孔板中已滅菌處理的蓋玻片上，每孔2 mL，孵育24 h后取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定，3%H2O2甲醇去除內(nèi)源性過氧化酶活性，10%正常山羊血清封閉15 min，加入鼠抗人G3BPⅠ抗，4℃濕盒過夜，加入相應(yīng)的Ⅱ抗，DAB顯色，置于顯微鏡下觀察，待顯色充分后，流水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，二甲苯透明，樹膠封片，鏡下觀察，照相。G3BP蛋白陽性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞漿，在×100倍視野下隨機(jī)選取計數(shù)10個視野，×200鏡頭下在每個視野中連續(xù)計數(shù)100個癌細(xì)胞，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)顯色計分，A:細(xì)胞漿無顯色(0分);B:胞漿呈淡黃色云霧狀(1分);C:胞漿呈黃色顆粒狀(2分);D:胞漿呈均勻深褐色(3分)，計數(shù)每個×400高倍視野下腫瘤細(xì)胞顯色深淺(A、B、C和D)各占的百分?jǐn)?shù)a、b、c和d，然后計算 A×a+B×b+C×c+D×d，取10個視野下的得分平均值，0～1.0 分者為弱陽性(+)，1.0 ～1.5 分者為中等陽性(++)，＞1.5分者為強(qiáng)陽性 (+++)。

2.3 CCK-8法檢測P162對Eca109細(xì)胞增殖抑制取對數(shù)生長期Eca109細(xì)胞以5×107/L密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，重復(fù)6孔，實(shí)驗重復(fù)3次。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日加入不同濃度的 P162(2.5、5、10、20、40 μmol/L)，同時設(shè)空白調(diào)零組及對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，然后將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀以450 nm處測定各孔吸光度(A)值，計算增殖抑制率(inhibitory rate，IR)。IR(%)=(1－實(shí)驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

2.4 倒置顯微鏡觀察P162對Eca109細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 取對數(shù)期貼壁生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，實(shí)驗組細(xì)胞加入P162，使其終濃度為15 μmol/L，對照組細(xì)胞加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液。于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.5 照射方法 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞給予0、2.5、5、10 μmol/L 四個濃度的 P162 培養(yǎng)48 h。在室溫下采用Varian 2300直線加速器6MV-X線照射，吸收劑量率為1.5 Gy/min，表面加1.5 cm標(biāo)準(zhǔn)等效填充物，源至標(biāo)本距離100 cm，照射野10 cm×10 cm，分別以0、2、4、6、8 Gy的劑量照射，每個劑量點(diǎn)下都有不同濃度處理的細(xì)胞受到照射。

2.6 集落形成實(shí)驗 將按上述照射方法照射后的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中放置4 h，使亞致死損傷得以修復(fù)，以0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，常規(guī)接種6孔板(2 mL/well)，1 000 cells/well，每個用藥濃度重復(fù)3孔，實(shí)驗重復(fù)3次，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 d，甲醇固定后吉姆薩染色，計數(shù)各組細(xì)胞數(shù)≥50個細(xì)胞的集落數(shù)。計算集落形成率(plating efficiency，PE)和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(surrival fraction，SF)。PE(%)= 集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%;SF(%)=各照射劑量PE/未照射PE×100%。采用SPSS統(tǒng)計軟件的多靶單擊模型SF=1 －(1 －e－D/D0)N擬合細(xì)胞劑量存活曲線［4］，得出各組放射敏感性參數(shù)(N、D0、Dq、SF2和 SERDq):放射增敏比(SERDq)=單純照射的Dq值/對照加藥的Dq值。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測食管癌干細(xì)胞標(biāo)記物p75NTR的表達(dá) 以0.25%胰蛋白酶消化處于對數(shù)期生長的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，離心(1 000 r/min，5 min)，細(xì)胞計數(shù)，用含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸為5×109/L的單細(xì)胞懸液。用PBS洗滌2次，離心(1 000 r/min，5 min)，懸浮于100 μL 的 PBS 中，混勻后加入20 μL PE-CD271進(jìn)行染色，避光孵育 25 min，加入500 μL鞘液過濾后上流式細(xì)胞儀檢測，設(shè)PE同型對照，分析表達(dá)p75NTR細(xì)胞的比例。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。集落形成實(shí)驗采用多靶單擊模型曲線擬合。

結(jié) 果

1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測食管癌細(xì)胞Eca109中G3BP的表達(dá)

G3BP表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，陽性表達(dá)情況見圖1，根據(jù)上述免疫細(xì)胞化學(xué)染色評定辦法，最終得到分值為1.920±0.346，可以認(rèn)為食管癌細(xì)胞Eca-109中G3BP表達(dá)較高。

2 P162對食管癌細(xì)胞Eca109增殖的影響

P162對食管癌細(xì)胞Eca109增殖有明顯抑制作用，隨著 P162濃度的增大和處理時間的延長，Eca109細(xì)胞增殖抑制率增大(P＜0.05)，不同濃度及作用時間下的增殖抑制率情況見圖2。

3 P162對Eca109細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

未經(jīng)處理的細(xì)胞貼壁，生長良好，圓形或不規(guī)則多邊形，細(xì)胞透亮，如鋪路石排列，見圖 3A。15 μmol/L P162處理24 h后(圖3B)，單位面積細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸改變，由貼壁逐漸脫落，胞體回縮變圓，體積縮小，形態(tài)不規(guī)則或呈圓形，隨時間延長此類細(xì)胞增多。處理48 h后(圖3C)細(xì)胞較多漂浮，無光澤，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清楚，胞質(zhì)內(nèi)較多顆粒樣及空泡狀結(jié)構(gòu)。72 h后(圖3D)細(xì)胞變圓呈球形，體積明顯增大，內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失。

Figure 3.The cell morphology.A:untreated Eca109 cells;B:treated with 15 μmol/L P162 for 24 h;C:treated with 15 μmol/L P162 for 48 h;D:treated with 15 μmol/L P162 for 72 h.圖3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

4 P162對Eca109細(xì)胞的放射增敏作用

在CCK-8實(shí)驗中，P162對Eca109細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性，為了避免P162本身對Eca-109 細(xì)胞的抑制，采用 2.5、5、10 μmol/L P162 作為增敏劑量。單靶多擊模型擬合細(xì)胞存活曲線見圖4。根據(jù)克隆形成實(shí)驗所得平均存活分?jǐn)?shù)(SF)，不同濃度的 P162處理后 D0、Dq 、N、SF2和 SERDq見表 1。不同濃度P162作用48 h后 D0、Dq、N、SF2和SERDq均低于對照組。

Figure 4.Survival curves of Eca109 cells treated with different concentrations of P162.圖4 不同濃度P162作用Eca-109細(xì)胞的存活曲線

表1 各組放射生物學(xué)參數(shù)Table 1.Radiobiology parameters

5 食管癌干細(xì)胞p75NTR細(xì)胞的比例分析

根據(jù)克隆形成實(shí)驗結(jié)果，經(jīng)5 μmol/L P162作用48 h后的Eca109細(xì)胞對射線更為敏感，故本實(shí)驗中采用5 μmol/L P162作用48 h后的Eca109細(xì)胞作為實(shí)驗組，對照組為未經(jīng)P162處理的細(xì)胞。當(dāng)給予0、2、4、6、8 Gy的X線照射后，實(shí)驗組和對照組中表達(dá)p75NTR細(xì)胞的比例見圖5、表2。對照組中照射劑量與表達(dá)p75NTR細(xì)胞比例的相關(guān)系數(shù)r=0.992(P＜0.01);實(shí)驗組中照射劑量與表達(dá)p75NTR細(xì)胞比例的相關(guān)系數(shù)r=0.988(P＜0.01)，提示隨著照射劑量的增加，兩組p75NTR的百分率逐漸增加。各照射劑量下的實(shí)驗組與對照組相比，表達(dá)p75NTR細(xì)胞的比例均有不同程度的減少(P＜0.01)。

Figure 5.The proportion of the Eca109 cells expressing p75NTRdetected by flow cytometry.A:control group irradiated with 8 Gy;B:drug treatment group irradiated with 8 Gy;C:control group without irradiation;D:drug treatment group without irradiation.圖5 FCM檢測表達(dá)p75NTREca109細(xì)胞的比例

表2 5 μmol/L P162聯(lián)合不同劑量X線后各組表達(dá)p75NTR Eca109細(xì)胞的比例Table 2.Effects of 5 μmol/L P162 with X-ray on proportion of the Eca109 cells expressing p75NTR(%)

討 論

食管癌是消化道常見惡性腫瘤之一，發(fā)展迅速且預(yù)后較差。全世界每年約有48萬新發(fā)病例，其發(fā)病率占全部惡性腫瘤的第8位［5］。食管癌確診時往往已到晚期，已發(fā)生轉(zhuǎn)移，且波及范圍過大，無法進(jìn)行手術(shù)切除，放療則成為晚期治療最重要的手段，然而大量臨床數(shù)據(jù)表明放療后大約有68%的食管癌會復(fù)發(fā)［6］。放射抗拒被認(rèn)為是放療失敗及腫瘤局部復(fù)發(fā)的重要原因。增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性成了近些年研究的熱點(diǎn)［7］。

目前針對腫瘤的放射增敏劑主要包括乏氧細(xì)胞放射修飾劑、非乏氧細(xì)胞增敏劑、細(xì)胞毒性藥物、生物治療劑、基因治療、中藥等。但是針對G3BP蛋白靶向治療的增敏劑尚未見報道。P162是基于全新藥物靶標(biāo)G3BP蛋白、利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計方法篩選到的一條全新肽序列，其結(jié)構(gòu)能與G3BP蛋白的NTF2蛋白域發(fā)生特異性結(jié)合，并能干預(yù)G3BP蛋白的功能磷酸化。實(shí)驗證實(shí)，P162對G3BP高表達(dá)的結(jié)腸癌HCT116具有選擇性殺死作用，并能夠增強(qiáng)順鉑等多種細(xì)胞毒素的抗癌效應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞無影響［3］。

本次實(shí)驗以高表達(dá)G3BP的食管癌細(xì)胞Eca-109為研究對象，先用CCK-8法檢測不同濃度P162對食管癌細(xì)胞Eca109增殖抑制率影響，結(jié)果顯示P162能抑制食管癌Eca109細(xì)胞的增殖，并且在一定的濃度范圍內(nèi)呈時間和劑量依賴性。集落形成實(shí)驗中，N值(外推值)是曲線的指數(shù)部分外延到Y(jié)軸的截距，代表所需擊中靶的次數(shù)和(或)細(xì)胞內(nèi)靶的個數(shù)，可以用來反映細(xì)胞對放射損傷的修復(fù)能力，如果N增大則表示細(xì)胞的修復(fù)能力增強(qiáng)，那么殺死細(xì)胞的放射劑量需要增大，放射抗拒性就增強(qiáng);D0值，又稱為細(xì)胞的平均致死劑量，是存活曲線直線部分斜率的倒數(shù)，表示能使曲線指數(shù)區(qū)下降63%所需的放射劑量，如果D0值越大，則放射抗拒性就越強(qiáng);Dq值，又稱準(zhǔn)域劑量，是由縱坐標(biāo)1.0處作一條與橫坐標(biāo)相平行的平行線，與外推線相交后的在橫坐標(biāo)上交點(diǎn)的投影點(diǎn)的數(shù)值，代表了細(xì)胞受損所需的準(zhǔn)閾劑量，如果Dq值增大，則細(xì)胞存活曲線的肩區(qū)增寬，放射抗拒性就增強(qiáng);SF代表受到劑量照射的存活分?jǐn)?shù)，2 Gy時的存活分?jǐn)?shù)SF2是代表細(xì)胞放射敏感性的重要指標(biāo)，如果SF2值越大，那么放射抗拒性就越強(qiáng)［8］。不同濃度P162作用48 h后 D0、Dq、SF2和 SERDq均低于對照組，證實(shí)P162可增加Eca109細(xì)胞對放射的敏感性，即對食管癌細(xì)胞有放射增敏作用。為初步探討其放療增敏機(jī)制，以食管癌干細(xì)胞為研究切入點(diǎn)。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells)是腫瘤中具有自我更新并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，與腫瘤的化療耐藥和放射抗拒［1］有關(guān)。Zhang等［9］通過對食管癌抗拒細(xì)胞株Seg-1R及TE-2R干細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)抗拒細(xì)胞株中干細(xì)胞表達(dá)增加。目前國內(nèi)外先后均有學(xué)者通過對p75NTR陽性細(xì)胞生物學(xué)特性及其成瘤性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)p75NTR陽性細(xì)胞具有無限增殖、自我更新和多向分化能力等腫瘤干細(xì)胞特性，認(rèn)為其可能為食管癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記［10－12］，所以本實(shí)驗選用食管癌干細(xì)胞p75NTR流式分選法分離出食管癌干細(xì)胞，在前期也運(yùn)用此方法做過類似研究［13］。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的增加，表達(dá)p75NTR細(xì)胞的比例呈增加趨勢，證實(shí)食管癌干細(xì)胞與食管癌放射抗拒有關(guān)。在各照射劑量下，P162聯(lián)合照射組與單純照射組相比，表達(dá)p75NTR陽性細(xì)胞的比例明顯低于對照組，說明P162聯(lián)合放療對食管癌干細(xì)胞有抑制作用。本次實(shí)驗初步證實(shí)P162對食管癌Eca109細(xì)胞有顯著的放療增敏效果，能抑制食管癌干細(xì)胞p75NTR表達(dá)。但其具體機(jī)制仍有待我們后續(xù)研究。

［1］ Pajonk F，Vlashi E，McBride WH.Radiation resistance of cancer stem cells:the 4 R's of radiobiology revisited［J］.Stem Cells，2010，28(4):639-648.

［2］ Okumura T，Shimada Y，Imamura M，et al.Neurotrophin receptor p75NTRcharacterizes human esophageal keratinocyte stem cells in vitro［J］.Oncogene，2003，22(26):4017-4026.

［3］ Zhang H，Zhang S，He H，et al.RasGAP-derived peptide 38GAP potentiates the cytotoxicity of cisplatein through inhibitions of Akt，EPK and NF-κB in colon carcinoma HCT116 cells［J］.Cancer Lett，2011，308(1):62-70.

［4］ 李運(yùn)明，封宗超，李小凱，等.應(yīng)用SPSS實(shí)現(xiàn)輻射劑量存活曲線的擬合［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2009，22(3):260-262.

［5］ Siersema PD，van Hillegersberg R.Treatment of locally advanced esophageal cancer with surgery and chemoradiation［J］.Curr Opin Gastroenterol，2008，24(4):535-540.

［6］ Wong R，Malthaner R.Combined chemotherapy and radiotherapy(without surgery)compared with radiotherapy alone in localized caicinoma of the esophagus［J］.Cochrance Database Syst Rev，2010，(1):CD002092.

［7］ 朱 睿，吳清明，龍 輝，等.食管癌放射抗拒與P－gp、HER－2及microRNA－296表達(dá)的相關(guān)性［J］.中國病理生理雜志，2012，28(3):550-552，564.

［8］ Harms-Ringdahl M，Nicotera P，Radford IR.Radiation induced apoptosis［J］.Mutat Res，1996，366(2):171-179.

［9］ Zhang X，Komaki R，Wang L，et al.Treatment of radioresistant stem-like esophageal cancer cells by an apoptotic gene-armed，telomerase-specific oncolytic adenovirus［J］.Clin Cancer Res，2008，14(9):2813-2823.

［10］ 孫志剛，黃盛冬，張寶仁，等.食管腫瘤干細(xì)胞的分選及鑒定的實(shí)驗研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2009，89(5):291-295.

［11］ Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414(6859):105-111.

［12］ Okumura T，Tsunoda S，Mori Y，et al.The biological role of the low-affinity p75 neurotrophin receptor in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2006，12(17):5096-5103.

［13］ 李 珂，龍 輝，吳清明，等.鉬對人食管癌細(xì)胞ECA-109的化療增敏作用及對食管癌干細(xì)胞p75NTR的影響［J］.世界華人消化雜志，2012，20(11):959-963.