莫世靜， 童秀珍， 鐘 茜， 鄧宇斌，4△

(1中山大學中山醫(yī)學院病理生理學教研室，廣東廣州510089;2中山大學附屬第一醫(yī)院血液科，廣東廣州510080;3中山大學腫瘤防治中心實驗研究部，廣東廣州510060;4中山大學附屬第一醫(yī)院轉化醫(yī)學中心實驗室，廣東廣州510080)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是一類存在于骨髓間質內(nèi)的非造血干細胞，近年來已被廣泛應用于缺血性腦卒中、脊髓損傷和缺血缺氧性神經(jīng)細胞的治療及修復。大量研究表明，移植的BM-MSCs能遷移至損傷局部微環(huán)境并分化為神經(jīng)元樣細胞或通過分泌各種營養(yǎng)因子等改善神經(jīng)功能從而促進損傷修復［1-2］。然而，BM-MSCs究竟通過何種機制促進神經(jīng)功能修復這一問題尚有爭議，明確BM-MSCs的細胞保護作用機制能更加有利于BM-MSCs的移植治療研究。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是由腎小管細胞合成分泌的細胞因子超家族成員。EPO及其受體EPOR在紅細胞、肝臟、腎臟和神經(jīng)元等多種組織中廣泛表達。本實驗在前期研究的基礎上，為了更好地闡明移植BM-MSCs對神經(jīng)細胞的保護作用及機制，為BM-MSCs的進一步應用提供實驗依據(jù)，應用體外氯化鈷(CoCl2)缺氧損傷的細胞共培養(yǎng)模型，RT-PCR檢測PC12細胞的Bcl-2和Bax表達，流式細胞術檢測PC12細胞凋亡，Western blotting檢測BM-MSCs的EPO表達，探討B(tài)M-MSCs對CoCl2誘導的神經(jīng)元樣PC12細胞凋亡的保護作用及其可能機制。

材料和方法

1 材料和主要試劑

SPF級SD大鼠，80 g，購自中山大學實驗動物中心，DMEM/F12和DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco，羊抗大鼠抗EPO購自R﹠D System。Hoechst 33258購于Sigma。PC12細胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(A-merican Type Culture Collection，ATCC)，Control siRNA及EPO siRNA購自Santa Cruz。

2 主要方法

2.1 大鼠BM-MSCs的分離和培養(yǎng) 大鼠斷頸處死，75%乙醇浸泡5 min，無菌條件下取雙側股骨，徹底清除附著其上的肌肉組織，剪斷干骺端暴露骨髓腔，DMEM/F12培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔至骨髓腔變白，制成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加人含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，3 d后更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細胞，以后每3 d換液1次，按1∶2傳代，取第5代BM-MSCs備用。

2.2 PC12細胞培養(yǎng)及分組 PC12細胞置于含10%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2的飽和濕度下培養(yǎng)，細胞匯集至80%時進行傳代接種后，將培養(yǎng)的細胞分別加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L CoCl2處理24 h或48 h，同時采用1∶50、1∶20、1∶15、1∶10 和 1∶5 細胞比的 BM-MSCs 與PC12細胞共培養(yǎng)。此外，將PC12細胞分為以下幾組:BM-MSCs-siCTL共培養(yǎng)+CoCl2處理24 h組和BM-MSCs-siEPO共培養(yǎng) +CoCl2處理24 h組，每組各設空白對照組和CoCl2單獨處理24 h組。

2.3 MTT檢測 將PC12細胞以4×104接種于96孔板，50 μL/well。在37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)過夜后，按實驗要求給予不同處理，處理完畢后，每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸出培養(yǎng)液，加150 μL DMSO，待其完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長490 nm處讀取吸光度(A)。存活率(%)=(實驗孔A值/對照孔A值)×100%。

2.4 Western blotting檢測EPO蛋白表達 BM-MSCs接種于6孔板，給予0.6 mmol/L CoCl2分別處理24和48 h，處理完畢后，加入細胞裂解液，4℃裂解30 min，取蛋白液，采用BCA法進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉移到NC膜上。用5%BSA封閉1 h，隨后加入羊抗大鼠EPO抗體(1∶1 000)，4℃過夜，用TBST洗3次，每次10 min。ECL法顯色，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集處理后的PC12細胞至2 mL的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用PBS緩沖溶液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min，用 loading buffer重懸細胞，加入Annexin V反應液室溫下避光孵育10～15 min。流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析凋亡情況。結果判斷:在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為FITC－/PI－;右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為FITC+/PI+;而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn) FITC+/PI－。

2.6 Hoechst 33258染色 將 PC12細胞 (4×104cells/well)接種于6孔板，4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS洗3次，5 mg/L Hoechst 33258染色液染色15 min，室溫下PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。細胞核出現(xiàn)彌漫均勻的低強度熒光記為正常細胞;細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或者顆粒狀熒光記為凋亡細胞。

2.7 RT-PCR檢測 分別于處理前和處理后24 h用RT-PCR法檢測。用0.6 mmol/L CoCl2及1∶15細胞比的BM-MSCs-siCTL或BM-MSCs-siEPO共培養(yǎng)處理PC12細胞，提取 PC12細胞總 RNA，測 A值計算RNA的純度。逆轉錄后，取cDNA做PCR，引物設計如下:β-actin上游引物5'-GAACCCTAAGGCCAAC-3'，下游引物 5'-TGTCACGCACGATTTCC-3'，擴增片段305 bp。EPO上游引物5'-ATTTGCGACAGTCGCGTTCT-3'，下 游 引 物 5'-GTATCCGCTTGAAGTGTTCG-3'，擴增片段307 bp。Bcl-2上游引物5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3'，下游引物 5'-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3'，擴增片段224 bp。Bax上游引物5'-AGACAGGGGCCTTTTTGTTAC-3'，下游引物 5'-GAGGACTCCAGCCACAAAGAT-3'，擴 增 片 段 482 bp。PCR反應條件為預變性94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃ 1 min，最后72 ℃ 10 min。以 β-actin為內(nèi)參照，30個循環(huán)，EPO、Bcl-2和Bax擴35個循環(huán)。產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像儀及Bio-ID軟件進行圖像和條帶灰度值分析。

2.8 分光光度法檢測caspase-9和-3活性 按不同條件處理PC12細胞，用胰酶消化，并收集至備用的細胞培養(yǎng)液中。600 r/min 4℃離心5 min收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌1次。同前吸盡上清后，加入100 μL裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。加入Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)后混勻，注意避免在混勻時產(chǎn)生氣泡。37℃孵育60～120 min。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時可測定吸光度值。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差(mean±SD)表示。組間比較行方差分析(ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 BM-MSCs共培養(yǎng)對CoCl2引起的PC12細胞活性下降的影響

0.1 、0.2、0.4、0.6 和 0.8 mmol/L CoCl2處理PC12細胞24 h和48 h，細胞活性分別為 (93.8±3.4)%、(91.7±3.1)%、(83.8±2.5)%，(44.0±7.5)%、(32.2±5.9)%和(90.0±4.0)%、(84.3±1.6)%、(68.7±2.9)%、(32.7±1.9)%、(25.4±0.9)%，見圖1A。同時，0.6 mmol/L CoCl2處理24 h和48 h后，PC12細胞活性下降為 (43.0±6.4)%和(33.8±5.7)%，而BM-MSCs共培養(yǎng)使細胞活性分別上升至 (49.4±6.8)%、(63.5±6.2)%、(77.9±3.8)%、(69.2±4.1)%、(67.1±6.0)%和(43.5±1.4)%、(61.3±4.3)%、(75.2±9.7)%、(65.7±10.7)%、(64.7±10.2)%，其中1∶15細胞比的效果最明顯，見圖1B。上述結果表明:0.6 mmol/L CoCl2處理24 h和48 h明顯降低PC12細胞活性(P＜0.01)，而BM-MSCs共培養(yǎng)可明顯抑制CoCl2引起的PC12細胞活性下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2 EPO siRNA對BM-MSCs EPO表達的影響

如圖2所示，BM-MSCs經(jīng)0.6 mmol/L CoCl2刺激24 h后，EPO mRNA與蛋白表達水平明顯上升，于48 h到達最高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而EPO siRNA轉染可明顯抑制CoCl2引起的BM-MSCs EPO mRNA與蛋白表達(P＜0.01)。

Figure 1.Effect of BM-MSCs on decreased viability of PC12 cells induced by CoCl2.A:PC12 cells were treated with CoCl2(0.1，0.2，0.4，0.6 and 0.8 mmol/L)for 6，12，24 and 48 h，and cell viability was assessed using MTT assay;B:the viability of PC12 cells co-cultured with BM-MSCs(BM-MSCs:PC12 cells=1∶50，1∶20，1∶15，1∶10 and 1∶5)and treated with CoCl2(0.6 mmol/L)was assessed 24 and 48 h later.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 mmol/L;##P ＜0.01 vs control;△△P ＜0.01 vs CoCl2.圖1 BM-MSCs對CoCl2誘導的PC12細胞活性下降的影響

Figure 2.Effect of EPO siRNA on mRNA(A)and protein(B)expression of EPO in BM-MSCs treated with 0.6 mmol/L CoCl2for 24 and 48 h.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control(without treatment);##P ＜0.01 vs CoCl2at the same time point.圖2EPO siRNA對BM-MSCs EPO表達的影響

3 EPO siRNA對BM-MSCs介導的PC12細胞保護作用的影響

Annexin V/PI雙染色法顯示24 h對照組PC12細胞早期凋亡率和晚期凋亡率分為(1.2±0.5)%和(2.2±0.4)%;0.6 mmol/L CoCl2處理PC12細胞24 h，凋亡率增加到(26.7±4.5)%和(34.6±5.7)%(P＜0.01)。BM-MSCs-siCTL共培養(yǎng)可以減少CoCl2引起的細胞凋亡，使細胞凋亡率降低至(6.1±0.8)%和(14.5±1.1)%，而EPO siRNA可明顯抑制BM-MSCs引起的細胞凋亡下降作用，細胞凋亡率由(18.8±1.8)%和(32.4±3.3)%僅降低至(13.3±1.5)%和(25.9±4.9)%(P＜0.01)，見圖3。Hoechst 33258熒光染色顯示正常組PC12細胞染色質分布均勻，為彌漫均勻的低強度熒光;CoCl2處理組細胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光;BMMSCs-siCTL共培養(yǎng)組凋亡細胞較陽性對照組明顯減少，而BM-MSCs-siEPO共培養(yǎng)組細胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的細胞明顯增多(P＜0.01)，見圖4。上述結果提示:BM-MSCs能有效抑制CoCl2的致細胞凋亡作用，BM-MSCs的抗凋亡作用可能與其上調(diào)EPO的表達有關。

4 Bcl-2和Bax的表達

PC12細胞經(jīng)0.6 mmol/L CoCl2處理24 h，可觀察到Bcl-2的表達下降和Bax的表達上升，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。BM-MSCs共培養(yǎng)可以有效抑制CoCl2引起的Bcl-2表達下降和Bax表達上升(P＜0.01)。BM-MSCs對PC12細胞基礎的Bcl-2和Bax表達無明顯影響(P＞0.05)。EPO siRNA的應用則可以明顯阻斷BM-MSCs的作用(P＜0.01)，見圖5。上述結果提示:BM-MSCs介導的細胞保護作用可能與其上調(diào)PC12細胞的Bcl-2表達和下調(diào)Bax表達有關。

Figure 3.Effect of EPO siRNA on the apoptosis of PC12 cells co-cultured with BM-MSCs detected by flow cytometry.PC12 cells were co-cultured with BM-MSCs-siCTL or BM-MSCs-siEPO at a ratio of 1∶15 and treated with CoCl2(0.6 mmol/L)for 24 h.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs CoCl2;△△P ＜0.01 vs CoCl2+BM-MSCs-siCTL.圖3 流式細胞術檢測EPO siRNA對與BM-MSCs共培養(yǎng)的PC12細胞凋亡的影響

Figure 4.Representative photographs and quantitative analysis of apoptotic PC12 cells determined by Hoechst 33258 staining.Arrows indicate the apoptotic cells.Scale bar=50 μm.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs CoCl2;△△P ＜0.01 vs CoCl2+BM-MSCs-siCTL.圖4 Hoechst 33258染色檢測PC12細胞凋亡形態(tài)

Figure 5.Effects of BM-MSCs and EPO siRNA on the mRNA expression of Bcl-2(A)and Bax(B)in PC12 cells assessed by RT-PCR.PC12 cells were co-cultured with BM-MSCs，BM-MSCs-siCTL and BM-MSCs-siEPO in the presence of CoCl2(0.6 mmol/L)for 24 h.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs CoCl2;△△P ＜0.01 vs BM-MSCs+CoCl2.圖5 BM-MSCs和EPO siRNA對PC12細胞Bcl-2及Bax表達的影響

5 Caspase-9和caspase-3的活性

PC12 細胞經(jīng)0.6 mmol/L CoCl2處理 24 h，可觀察到caspase-9和caspase-3的活性明顯增強，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。BM-MSCssiCTL共培養(yǎng)可以有效抑制CoCl2引起的caspase-9和caspase-3的活性增加(P＜0.01)。EPO siRNA明顯阻斷BM-MSCs介導的caspase-9和caspase-3的活性下降(P＜0.01)，見圖6。這一結果表明:BMMSCs介導的細胞保護作用可能與其下調(diào)PC12細胞caspase-9和caspase-3的活性有關。

Figure 6.Effects of BM-MSCs and EPO siRNA on the activity of caspase-9(A)and caspase-3(B)in PC12 cells assessed by fluorometric assay kits.PC12 cells were co-cultured with BM-MSCs-siCTL and BM-MSCs-siEPO in the presence of CoCl2(0.6 mmol/L)for 24 h.Mean± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs CoCl2;△△P ＜ 0.01 vs CoCl2+BM-MSCssiCTL.圖6 BM-MSCs和EPO siRNA對PC12細胞caspase-9和caspase-3活性的影響

討 論

缺血性腦卒中是一種病情嚴重、預后不良的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，也是一個復雜的病理生理過程，包括連續(xù)發(fā)生的原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷［3］。原發(fā)性腦損傷是缺血缺氧后當時被動發(fā)生的損傷，主要包括損傷局部神經(jīng)元、膠質細胞及血管等支持結構的破壞;隨后發(fā)生的是長達數(shù)日或數(shù)周的繼發(fā)性損傷，繼發(fā)性腦損傷的病理生理過程包括激活多個化學通路如缺血、缺氧、自由基產(chǎn)生、凋亡、變性受體上調(diào)及炎癥級聯(lián)反應，從而導致在原發(fā)性損傷中幸存的損傷區(qū)周圍的各類細胞大量死亡，產(chǎn)生比原發(fā)損傷更嚴重的影響［3］。大量實驗證實繼發(fā)性腦損傷是引起大腦功能喪失的主要原因。因此，恢復缺血腦組織的供血供氧，促進神經(jīng)功能修復成為缺血性腦卒中治療的首要目標。

BM-MSCs作為一種獲取方便，擴增容易，遺傳背景穩(wěn)定，免疫原性低的成體干細胞，已被廣泛應用于移植治療缺血性腦卒中［4］。大量研究表明BM-MSCs可遷移至腦損傷局部區(qū)域并通過其旁分泌機制增加某些神經(jīng)營養(yǎng)因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等的濃度，促進缺血性腦卒中的神經(jīng)功能修復［5］。此外，EPO作為一種造血生長因子，不僅在多種細胞中廣泛表達，而且廣泛參與促紅細胞生成、細胞擴增、血管形成，抗炎及抗凋亡過程［6-11］。生理情況下，EPO含量維持穩(wěn)定，當受到缺氧性刺激時，EPO表達增加。調(diào)控EPO表達的主要元件為缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors，HIF)。當受到內(nèi)外源性缺氧信號刺激時，HIF-1α脫離降解，激活EPO基因的缺氧反應元件(hypoxia responsive element，HRE)，從而增強EPO的表達［12］。EPO的主要生理功能是促進紅系祖細胞分裂、分化為成熟紅細胞，以增加循環(huán)中紅細胞數(shù)量。近年來有研究表明EPO可通過與其受體EPOR結合激活下游Janus激酶2(Janus kinas 2，JAK2)、信號轉導和轉錄活化蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)等信號通路抑制神經(jīng)元凋亡［13］。Wu等［14］的研究更是表明EPO具有明顯抑制PC12細胞凋亡的作用。PC12細胞作為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株，具有合成、代謝及運輸神經(jīng)遞質等特性，已被長期用作模擬神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病的體外模型［15］。

細胞凋亡過程中，多個信號轉導通路及轉錄因子被激活。其中Bcl-2家族成員被認為是調(diào)節(jié)線粒體外膜(mitochondrial outer membrane，MOM)通透性的關鍵因子，MOM可通過激活下游caspase-9并最終活化凋亡執(zhí)行者 caspase-3，從而誘發(fā)細胞凋亡［16］。Bcl-2家族成員分為2類，一類具有抑制凋亡作用，如Bcl-XL和Bcl-2等，而另一類具有促凋亡作用，如Bax和Bak等。

在本實驗中我們首先觀察了不同細胞比的BMMSCs共培養(yǎng)對CoCl2引起的PC12細胞活性下降的影響，結果顯示0.6 mmol/L CoCl2處理明顯降低PC12細胞活性，而 BM-MSCs共培養(yǎng)可有效抑制CoCl2引起的PC12細胞活性下降。同時，我們還觀察了0.6 mmol/L CoCl2誘導的BM-MSCs EPO mRNA與蛋白表達情況，結果顯示BM-MSCs經(jīng)0.6 mmol/L CoCl2刺激后，EPO mRNA與蛋白表達水平明顯上升，而EPO siRNA可有效抑制EPO的表達水平。此外，F(xiàn)CM與Hoechst 33258染色結果表明BM-MSCs共培養(yǎng)減少了CoCl2誘導的PC12細胞凋亡，而這一抗凋亡作用可被EPO siRNA阻斷，提示BM-MSCs介導的細胞保護作用與其上調(diào)EPO表達有關。此外，RT-PCR與caspase-9、-3活性檢測結果顯示EPO siRNA可明顯阻斷BM-MSCs介導的Bcl-2表達上調(diào)、Bax表達下調(diào)及caspase-9、-3活性下降。這些結果表明BM-MSCs的細胞保護作用可能與其上調(diào)PC12細胞的Bcl-2表達、下調(diào)Bax表達及降低caspase-9、-3活性有關。

綜上所述，本文證實BM-MSCs共培養(yǎng)能有效抑制化學性低氧模擬劑CoCl2誘導的PC12細胞損傷，而EPO可能是介導這一作用的關鍵因子。這為BMMSCs應用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復的治療提供了新的實驗依據(jù)。

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