楊文青， 馬 晶， 劉 爭， 蘆永良， 余華榮△

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種老年人最常見的神經(jīng)退行性疾病，以進行性的認(rèn)知行為障礙為臨床特征。1906年該病被正式命名并明確其病理改變主要為神經(jīng)元的丟失以及老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成。到上世紀(jì)八十年代，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，明確了老年斑的主要成分是淀粉樣β蛋白(amyloid β-protein，Aβ)，而神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分是過度磷酸化的tau蛋白。

根據(jù)國際疾病分類，AD分為家族遺傳性AD(familial Alzheimer disease，F(xiàn)AD)和散發(fā)性AD(sporadic Alzheimer disease，SAD)，其中 FAD 占總 AD 的5%，且病因明確，主要由淀粉樣蛋白前體(amyloid protein precursor，APP)、早 老 素 1(presinilin 1，PS1)、早老素2(presinilin 2，PS2)等基因突變所致;而SAD則病因不明確，傾向于多因素、多途徑、多方面共同作用的結(jié)果。近來研究表明，AD患者在疾病早期尚未出現(xiàn)病理改變和臨床癥狀之前就已經(jīng)出現(xiàn)了大腦對葡萄糖利用的降低［1］，而流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)2型糖尿病和AD有著密切聯(lián)系［2］，因此，科學(xué)家提出AD是一種“3型糖尿病”，亦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)分泌疾病［3］。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是一種甲基亞硝基脲產(chǎn)物，分子量為265 D，具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用。在外周，STZ可以選擇性地破壞胰腺β細(xì)胞，引起糖尿病。腦室注射STZ可以破壞中樞胰島素受體的磷酸化，引起胰島素信號通路障礙。有不少研究表明［4］，側(cè)腦室(intracerebroventricular，ICV)注射小劑量STZ能導(dǎo)致腦局部的糖利用和能量代謝障礙，引起大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙和膽堿能神經(jīng)元丟失，而外周的胰島結(jié)構(gòu)和胰島素的基因表達(dá)未受影響。目前用于研究AD的動物模型主要有藥物損傷模型、轉(zhuǎn)基因動物模型和自然衰老模型等，但沒有哪一種模型能較全面地再現(xiàn)AD的病理改變及分子變化。本實驗通過ICV-STZ建立AD動物模型并系統(tǒng)檢測大腦胰島素信號通路中相關(guān)分子的改變，較全面地反映胰島素信號通路在AD中的作用，探討引起AD可能的作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠16只，體重320～380 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，采用Excel表自動產(chǎn)生隨機數(shù)字將大鼠分成2組，即對照組(control)和模型組(STZ)。飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF，每4只一籠，大鼠自由進食和攝水。

1.2 試劑 STZ(Sigma);糖原合成酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)抗體，磷酸化糖原合成酶激酶 3β(p-GSK-3β)抗體，tau抗體，p-tau抗體(Bioworld);Aβ1-40，Aβ1-42(北京博奧森);胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)抗體(武漢三鷹生物公司);Ⅱ抗均購自北京中杉金橋生物公司;免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR反應(yīng)液(TaKaRa，中國大連)。

2 方法

2.1 側(cè)腦室注射STZ SD大鼠用10%水合氯醛(4 mg/kg)麻醉后固定在顱腦立體定位儀(成都泰盛科技有限公司)上，常規(guī)局部消毒，頭頂部沿矢狀縫切開皮膚，分離骨膜，根據(jù)包新民的《大鼠腦立體定向圖譜》定位，在前囟后0.8 mm、矢狀縫旁開1.5 mm處用錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜，25 μL微量進樣器自定位點進針，深度3.5 mm緩慢注入約5 μL液體(注射時間為5 min，STZ組注射1.5 mg/kg STZ，用生理鹽水溶解，control組則用等量生理鹽水代替STZ)，注入后留針5 min，以保證溶液充分彌散，再緩慢退出。術(shù)后第3 d再重復(fù)注射1次。

2.2 行為學(xué)檢測 第1次手術(shù)后21 d采用Morris水迷宮進行行為學(xué)檢測。Morris水迷宮為一個不銹鋼的圓柱形水池，直徑120 cm，高50 cm，水池壁標(biāo)明4個入水點，盛水后水深約30 cm，水溫控制在22～25℃，將一直徑11 cm、高29 cm的平臺放置于水池中間，平臺在水面下1 cm。(1)定位航行實驗:將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在120 s內(nèi)尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。如大鼠不能在120 s內(nèi)找到平臺，則由實驗者用手牽引其到平臺上停留30 s，再放回籠中，間隔30 min再進行下一次實驗。此項實驗反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。(2)空間探索實驗:撤走平臺，將大鼠從任意一個入水點放入池中，記錄其在120 s內(nèi)在原平臺所在象限活動的時間，測試大鼠的記憶保持能力。

2.3 動物取材 每組各取3只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后，剪開胸腹腔，暴露心臟和肝臟，剪開右心耳，從左心室用生理鹽水灌注至肝臟無血色，再用4%多聚甲醛灌注約120 mL，然后迅速取出腦組織，放入4%多聚甲醛固定24 h，行免疫組化切片染色。其余大鼠均采用斷頸取腦，然后分離出皮質(zhì)和海馬放入液氮中備用。

2.4 免疫組織化學(xué)染色 首先將組織進行石蠟包埋，行冠狀面切片，貼片后烘烤。再將片架和玻片一同放入60℃二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各20 min，后依次放入不同濃度乙醇各3 min，PBS洗5 min。接著用枸櫞酸緩沖液充分暴露抗原，再將標(biāo)本浸于封閉血清20 min后再滴Ⅰ抗4℃過夜。第2 d，37℃復(fù)溫1 h后再滴Ⅱ抗和Ⅲ抗各37℃ 20 min。DBA顯色，蘇木素染色，5組乙醇脫水各1 min，3組二甲苯透明各5 min，封片。顯微鏡觀察并拍照。

2.5 Western blotting 先將組織放入玻璃勻漿器中的球狀部位，碾碎組織，再加入相應(yīng)裂解液和PMSF，使裂解液中的PMSF的濃度為1 mmol/L，采用超聲波細(xì)胞粉碎機進行組織粉碎，放置約30 min后移入EP管中，4℃、11 000×g離心5 min，取少量上清液做BCA蛋白定量分析，其余上清液按4∶1加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃水中煮沸5 min后放入-80F℃冰箱備用。每組取適量樣本行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)上，5% 脫脂奶粉封閉，Ⅰ抗(IDE 1∶125、tau 1∶25、ptau 1∶500、GSK-3β 1∶500和 p-GSK-3β 1∶500)4℃孵育過夜，TBST洗膜3×5 min，Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜 3×5 min，通過 Bio-Rad ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，進行曝光分析顯影。

2.6 實時定量RT-PCR 取約30 mg的組織放入研缽中，邊加液氮邊研磨直至成粉末狀，再加入約1 mL的Trizol繼續(xù)研磨至液體清亮;移入EP管中，4℃、12 000×g離心5 min;取上清液加入約0.3 mL的氯仿，劇烈振蕩混勻，4℃、12 000×g離心15 min，取上清液，加入等量的異丙醇，4℃ 12 000×g離心10 min;棄去上清，加入 1 mL 75%乙醇，4℃、12 000×g離心5 min;棄上清加入適量的DEPC水，檢測mRNA的濃度。用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再配成10 μL體系的PCR反應(yīng)液。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 2 min預(yù)變性;95℃ 5 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s，40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 實時定量RT-PCR各引物的序列Table 1.Primer pairs for real-time quantitative RT-PCR

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 18.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗以及方差齊性檢驗，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 體重變化

大鼠手術(shù)后出現(xiàn)不同程度的體重下降，在第3周開始回升。與control組相比，STZ組體重下降更為明顯，且恢復(fù)也相對較慢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.Body weight of the rats in control group and STZ group at different time points.Mean±SD.n=8.圖1 2組大鼠不同時期的體重

2 血糖變化

分別于腦室注射藥物前(第1 d)和動物處死前(第26 d)取尾靜脈血檢測末梢血糖，2組大鼠在處死前血糖檢測結(jié)果無明顯差異(P＞0.05)，見圖2。

Figure 2.Blood glucose in control group and STZ group.Mean± SD.n=8.圖2 2組大鼠在建模前后血糖的比較

3 大腦重量變化

大鼠處死后立即取出大腦組織進行稱重，STZ組的大腦重量較control組偏輕，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖3。

4 Morris水迷宮結(jié)果

4.1 定位航行實驗 在4 d的定位航行訓(xùn)練中，2組大鼠均表現(xiàn)出一定的學(xué)習(xí)記憶能力，但STZ組大鼠從第1 d起逃避潛伏期就較control組明顯延長(P＜0.01)，并且主要沿池壁游，表現(xiàn)出一定的盲目性，表明其學(xué)習(xí)能力較control組明顯降低，見圖4。

Figure 3.Brain weight at the end of the experiment.Mean±SD.n=8.圖3 2組大鼠處死后大腦重量的比較

Figure 4.Comparison of escape latency time of rats in the two groups in Morris water maze test.Mean ± SD.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 2組大鼠逃避潛伏時間的比較

4.2 空間探索實驗 第5 d撤走平臺后，control組大鼠在原平臺所在象限停留的時間明顯較長，而STZ組大鼠停留時間短，兩者有顯著差異(P＜0.01)，表明STZ組大鼠的記憶能力明顯降低，見圖5。

Figure 5.Comparison of spatial probe time of rats in the two groups.Mean ± SD.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 2組大鼠空間探索時間的比較

5 大鼠大腦Aβ1-40和Aβ1-42的變化

STZ組大鼠 Aβ1-40和 Aβ1f-42較 control組明顯增加(主要在皮質(zhì)區(qū)，海馬區(qū)不明顯)，而control組則幾乎未見Aβ沉積，見圖6。

Figure 6.STZ increased Aβ1-42(A，B)and Aβ1-40(C，D)levels in the cerebral cortex(immunohistochemical staining，×400).A，C:STZ group;B，D:control group.圖6 STZ導(dǎo)致Aβ1-40和Aβ1-42在皮質(zhì)區(qū)沉積的增加

6 ICV-STZ對大腦胰島素信號通路的影響

ICV-STZ導(dǎo)致皮質(zhì)和海馬的胰島素mRNA和胰島素受體mRNA較control組均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05或 P ＜0.01)，見圖7。

7 ICV-STZ對IDE mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

STZ組大鼠的IDE水平明顯減少，與control組比較有顯著差異(P ＜0.05或 P ＜0.01)，見圖8。

8 ICV-STZ增加GSK-3β的活性和tau蛋白的磷酸化水平

STZ組的 p-GSK-3β量明顯減少，p-GSK-3β/GSK-3β的比值明顯低于對照組(P＜0.05)。2組中總tau蛋白的水平無顯著差異，但STZ組p-tau的水平較control組明顯升高(P＜0.01)，見圖9。

討 論

人體大腦只占人體體重的2%，但是在基礎(chǔ)代謝下，大腦對葡萄糖的消耗占人體葡萄糖消耗總量的50%［5］，人體大腦儲存能量及利用其它營養(yǎng)物質(zhì)的能力十分有限，腦的糖原儲存只有0.1%，僅夠維持幾分鐘的正?；顒?，并且不能自身合成和分泌葡萄糖。因此，只能通過外周血液持續(xù)將葡萄糖運送至大腦以維持大腦的正常功能。隨著年齡的增加，人體大腦對葡萄糖的利用會有不同程度的下降，而在AD病人這種下降程度則更加明顯［6］。近年來采用腦正電子發(fā)射斷層掃描成像(positron emission tomography，PET)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在AD患者疾病早期階段就已經(jīng)出現(xiàn)了大腦對葡萄糖利用的降低［7］，有研究發(fā)現(xiàn)在AD早期階段大腦葡萄糖利用下降了45%。以上研究提示大腦葡萄糖代謝降低很可能是AD的一個病因，而不是AD發(fā)展的結(jié)果。而胰島素調(diào)節(jié)機體組織對葡萄糖的攝取和利用，近30年來人們研究發(fā)現(xiàn)大腦胰島素受體主要分布在嗅球、大腦皮層、海馬、腦扁桃體和下丘腦;大腦胰島素受體的主要功能包括控制機體的能量平衡，調(diào)控突觸的可塑性和調(diào)節(jié)認(rèn)知功能以及與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性變［8］，當(dāng)側(cè)腦室注射STZ后，STZ破壞了胰島素信號通路，引起葡萄糖利用降低，影響了乙酰輔酶A和乙酰膽堿的水平，阻礙膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降［9］。

Figure 7.Effects of ICV-STZ on insulin(INS)and insulin receptor(INSR)mRNA expression in cerebral cortex and hippocampus.The mRNA expression was measured by real-time quantitative RT-PCR and normalized to 18S RNA.Mean±SD.n=5.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖7 ICV-STZ對大腦皮質(zhì)和海馬的胰島素和胰島素受體mRNA表達(dá)的影響

Figure 8.Effects of ICV-STZ on insulin-degrating enzyme(IDE)mRNA and protein expression.The mRNA expression in the cerebral cortex(A)and hippocampus(B)was measured by real-time quantitative RT-PCR and normalized to 18S RNA.The protein expression in the hippocampus(C)was measured by Western blotting and normalized to β-actin.Mean ± SD.n=5.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖8 ICV-STZ對IDE mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

Figure 9.ICV-STZ enhanced GSK-3β activity and tau phosphorylation.The protein expression in the hippocampus was measured by Western blotting.Mean ± SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control.圖9 ICV-STZ增加GSK-3β的活性和tau的磷酸化水平

中樞神經(jīng)組織的胰島素與胰島素受體結(jié)合后主要通過2條途徑將信號下傳，一條是經(jīng)胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)調(diào)節(jié)葡萄糖代謝;另一條是經(jīng)Shc/Raf/MAPK調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖，分化。GSK-3β作為胰島素信號通路中一種重要的激酶，其活性受胰島素信號調(diào)節(jié)，當(dāng)胰島素信號通路發(fā)生障礙，則通過IRS-PI3K-Akt(蛋白激酶B)途徑使GSK-3β的磷酸化水平降低，增加GSK-3β的活性，調(diào)節(jié)糖原的合成;同時GSK-3β與tau的磷酸化有密切聯(lián)系［10］。GSK-3β被認(rèn)為是tau重要的激酶之一，其活性增加可促進p-tau的增多，進而導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成。有研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者大腦中，tau至少有10個過度磷酸化的位點，異常磷酸化的tau喪失了與微管結(jié)合的生物學(xué)活性，并在神經(jīng)元內(nèi)異常聚集最終形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，增加了氧化應(yīng)激反應(yīng)從而引起神經(jīng)纖維退行性變以及誘發(fā)一系列病理生理反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、線粒體功能的障礙和壞死［11］。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):胰島素和胰島素受體水平降低表明STZ損傷胰島素信號通路，抑制了PI3K和Akt，從而增加了GSK-3β的活性，進而導(dǎo)致tau蛋白的過度磷酸化，而本實驗各組總tau無明顯改變，故p-tau/tau的比值增大。但亦有研究表明tau缺乏可以緩解Aβ誘導(dǎo)的LTP損傷［12］，表明Aβ與tau之間存在較為復(fù)雜的關(guān)系。

Aβ被認(rèn)為是引起AD認(rèn)知障礙最重要的病理特征，由APP被APP β位分解酶1(β-site APP-clfeaving enzyme 1，BACE1)經(jīng)過一系列蛋白水解反應(yīng)催化而來，主要包括Aβ1-40和Aβ1-42。通常認(rèn)為Aβ的異常積累導(dǎo)致其過分聚合，而正是這些過度聚合的Aβ分子對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有損害作用［8］。但是有研究顯示，在ICV-STZ的AD轉(zhuǎn)基因動物模型中，早期出現(xiàn)認(rèn)知障礙時，動物大腦中Aβ的沉積并不明顯，因此Aβ并非是引起SAD的罪魁禍?zhǔn)?，而可能是通過正反饋途徑加重了大腦的功能障礙。有研究表明，胰島素能通過影響APP的代謝來調(diào)節(jié)Aβ的形成，而Aβ可以競爭性結(jié)合胰島素受體，從而阻礙胰島素信號通路，進而導(dǎo)致Aβ和p-tau的增多，因此形成一種惡性循環(huán)。IDE是一種既能催化胰島素降解和負(fù)性調(diào)控胰島素信號，同時也能降解可溶性Aβ，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞外Aβ水平的酶。有研究表明，在AD患者大腦IDE降解Aβ的能力下降了50%;在IDE基因敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)其大腦Aβ聚集明顯增加同時伴有葡萄糖不耐受和血清胰島素濃度的增加［13］。本文研究可知，胰島素mRNA表達(dá)降低一方面使胰島素信號下傳減少，另一方面則使得IDE表達(dá)水平也隨之減少，導(dǎo)致Aβ的降解減少進而促使Aβ的沉積增加，而Aβ與tau之間可能存在著某些相互作用從而加重AD的病理改變和認(rèn)知障礙。

STZ是一種選擇性破壞具有合成和分泌胰島素功能的細(xì)胞的藥物，在外周可以直接破壞胰島β細(xì)胞引起Ⅰ型糖尿病或胰島素抵抗;而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，本文研究表明STZ可以減少皮質(zhì)和海馬的胰島素和胰島素受體mRNA的表達(dá)，從而破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身胰島素的合成，降低了中樞神經(jīng)系統(tǒng)對外周胰島素的敏感性，進而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)胰島素信號的障礙。本研究亦表明，胰島素信號通路的損害導(dǎo)致其下游GSK-3β的活性增加，IDE表達(dá)減少，最終使得Aβ沉積增加，p-tau表達(dá)增多，tau的微管結(jié)合能力降低。而這些在大鼠模型腦組織的病理改變與AD患者的表現(xiàn)是一致的。因此，大腦胰島素信號通路障礙可以引起阿爾茨海默病樣的病理改變和臨床特征，亦揭示了AD可能的發(fā)病機制:(1)胰島素信號通路障礙導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能降低，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降;(2)胰島素信號通路障礙影響葡萄糖轉(zhuǎn)運體，導(dǎo)致細(xì)胞攝入葡萄糖減少，能量代謝降低，表現(xiàn)為神經(jīng)元功能下降、萎縮或丟失;(3)胰島素信號通路障礙使其下游的GSK-3β活性增加，導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化;(4)胰島素相關(guān)的IDE表達(dá)異常使Aβ不能被及時有效清除，導(dǎo)致Aβ沉積增加最終加重了病理改變和臨床特征。同時ICV-STZ可以作為一種用于研究AD的可行的動物模型。

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