師憲平， 藍(lán)曉瑩， 溫創(chuàng)宇， 陳 鑫， 劉煥亮， 黃美近

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是目前發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，其中彌漫性大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見(jiàn)的NHL。DLBCL是大B型淋巴細(xì)胞彌漫性惡性增生性疾病，在最近的10～20年間發(fā)病率逐漸增加。DLBCL在西方國(guó)家占成人非霍奇金淋巴瘤30%～40%，在發(fā)展中國(guó)家高達(dá)60%。按照腫瘤細(xì)胞來(lái)源和臨床表現(xiàn)DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞樣彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(germinal center B cell-like diffuse large B-cell lymphoma，GCB-DLBCL)、活化性B細(xì)胞樣彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(activated B celllike diffuse large B-cell lymphoma，ABC-DLBCL)和原發(fā)性縱膈B細(xì)胞淋巴瘤(primary mediastinal B-cell lymphoma，PMBL)3型。迄今，利妥昔單抗聯(lián)合CHOP方案(rituximab plus CHOP，R-CHOP;利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和強(qiáng)的松)被國(guó)際上公認(rèn)為治療侵襲性NHL的經(jīng)典療法，在治療低度惡性NHL特別是GCB型DLBCL取得了良好的效果。然而在用藥過(guò)程中產(chǎn)生了極大的耐藥復(fù)發(fā)問(wèn)題及并發(fā)癥(支氣管痙攣、心律失常、肝功能衰竭、呼吸困難等)，嚴(yán)重影響了治療效果［1］，迫切需要篩選出作用機(jī)制各異的有效化合物治療DLBCL。

SNS-032(BMS-387032)是一種新型的氨噻唑化合物，因其對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclindependent kinase，CDK)的活性具有抑制作用，最初被定義為 CDK2、7、9 的抑制劑［2］。已有報(bào)道證明SNS-032可用于多種腫瘤，如急性粒細(xì)胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)［3］、慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)［4］、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)等［5-6］的治療，目前該化合物已處于CLL、MM及其轉(zhuǎn)移性難治性實(shí)體瘤的I期臨床試驗(yàn)階段。本研究以GCB-DLBCL細(xì)胞株OCI-LY-19為研究對(duì)象，觀察SNS-032對(duì)OCI-LY-19細(xì)胞的抗腫瘤活性，并分析其可能的作用機(jī)制，以期探討該化合物在彌漫性大B淋巴瘤治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

1 材料

OCI-LY-19細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所。胎牛血清購(gòu)自HyClone。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco。MTS購(gòu)自Promega。碘化丙啶(propidium iodide，PI)和Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma-Aldrich?？咕巯佘斩姿?核糖聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PRAP］、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3、9前體(procaspase-3和procaspase-9)、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3、9切割體(cleaved caspase-3和 cleaved caspase-9)、蛋白絲/蘇氨酸激酶 (protein serine/threonine kinase，Akt)、p-Akt、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)和 p-ERK抗體為 Cell Signaling產(chǎn)品?？顾铇蛹?xì)胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)、X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子5(signal transductor and activator of transcription 5，STAT5)和p-STAT5抗體購(gòu)自Upstate Technology。HRP－抗鼠/兔 Ig抗體為Pierce Biotechnology產(chǎn)品。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與加藥 OCI-LY-19細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。實(shí)驗(yàn)所用的SNS-032由DMSO溶解，貯存濃度為20 mmol/L。加藥時(shí)用滅菌的PBS將SNS-032稀釋至一定濃度，計(jì)算加藥的體積，確保每組中DMSO的量一致(DMSO的終濃度控制在0.1%以下)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中所有的對(duì)照組(control，C)均加入與加藥組等比例的DMSO和PBS混合液。

2.2 細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 用MTS法測(cè)細(xì)胞活力抑制情況，取生長(zhǎng)良好的OCI-LY-19細(xì)胞，配成單細(xì)胞懸液，稀釋為2×108cells/L后，加至96孔板，對(duì)照組加入RPMI-1640培養(yǎng)基50 μL;實(shí)驗(yàn)組每孔加入含SNS-032的培養(yǎng)基50 μL，使 SNS-032終濃度為0、0.08、0.16、0.31、0.63 和 1.25 μmol/L，每組 3 個(gè)重復(fù)孔。加入不同濃度SNS-032作用68 h后于實(shí)驗(yàn)各孔分別加MTS試劑20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光度值(測(cè)定波長(zhǎng)490 nm)，以濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活力為縱坐標(biāo)繪制SNS-032對(duì)OCI-LY-19細(xì)胞生長(zhǎng)活力抑制的柱狀圖，用GraphPad Prism 4.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)。

2.3 PI單染細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè) OCI-LY-19細(xì)胞經(jīng)0.5 μmol/L SNS-032 處理，5 h 后加入已過(guò)濾的 PI(1∶100)染液，多時(shí)點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察，顯微鏡TRITC熒光通道拍照記錄PI陽(yáng)性細(xì)胞(紅染細(xì)胞)。

2.4 Annexin V/PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)按照Sigma-Aldrich公司提供的試劑說(shuō)明書(shū)操作，重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)設(shè)有不同藥物濃度組。收集細(xì)胞，1×binding buffer洗滌細(xì)胞后，Annexin V工作液100 μL室溫孵育 15 min，檢測(cè)前每管加 PI 1 μL上機(jī)。該法能區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，取右下象限和右上象限的總和(即Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞群)計(jì)為凋亡細(xì)胞。

2.5 Western blotting檢測(cè) 細(xì)胞密度調(diào)整至2×108cells/L，不同時(shí)點(diǎn)和不同濃度的SNS-032處理后收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液RIPA(含蛋白酶抑制劑)充分裂解細(xì)胞提取蛋白，Bio-Rad蛋白濃度試劑盒紫外分光750 nm波長(zhǎng)定量蛋白濃度。100～130 V恒壓電泳約90 min，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜約90 min，5%牛奶室溫封閉1 h，I抗4℃過(guò)夜次日曝光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 4.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用單因素方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SNS-032抑制OCI-LY-19細(xì)胞活力

用不同濃度的SNS-032處理OCI-LY-19細(xì)胞72 h后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物濃度達(dá)到0.31 μmol/L時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)活力出現(xiàn)了明顯的抑制(P＜0.05)。隨著藥物濃度增加，SNS-032對(duì)細(xì)胞活力的抑制就更加明顯，見(jiàn)圖1。經(jīng)計(jì)算，SNS-032對(duì)OCI-LY-19細(xì)胞的IC50是 0.358 μmol/L。

Figure 1.Effect of SNS-032 on cell viability of DLBCL cell line OCI-LY-19.Mean ± SD.n=3.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 μmol/L).圖1 SNS-032對(duì)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞株OCI-LY-19活力的影響

2 SNS-032誘導(dǎo)OCI-LY-19細(xì)胞凋亡

0.5 μmol/L SNS-032 處理 OCI-LY-19 細(xì)胞后取6、12、26和36 h細(xì)胞分別進(jìn)行PI單染并在熒光顯微鏡下觀察，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)12 h后PI染色陽(yáng)性細(xì)胞(紅染細(xì)胞)明顯增多(P＜0.05)，說(shuō)明SNS-032明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。圖3結(jié)果顯示，與空白組比較，0.25 μmol/L 組、0.5 μmol/L 組和 0.75 μmol/L組細(xì)胞凋亡比例(右下象限和右上象限的總和數(shù))明顯增加，分別是7%、32%和52%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這更進(jìn)一步說(shuō)明了SNS-032能明顯誘導(dǎo)OCI-LY-19細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Figure 2.SNS-032(0.5 μmol/L)induced death of DLBCL cell line OCI-LY-19(PI staining，×100).圖2 SNS-032(0.5 μmol/L)誘導(dǎo)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞株OCI-LY-19死亡

3 SNS-032對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

PARP切割呈SNS-032劑量與時(shí)間依賴性，procaspase-3、procaspase-9、XIAP與 Mcl-1 的表達(dá)隨藥物濃度和處理時(shí)間的增加而減少，cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)明顯增多，Bcl-2沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)圖4。這說(shuō)明SNS-032能明顯增加 caspase-3與caspase-9前體的降解，誘導(dǎo)OCI-LY-19細(xì)胞凋亡，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路與抑制XIAP和Mcl-1表達(dá)密切相關(guān)。

Figure 4.Effects of SNS-032 on the expression of apoptosis-related proteins PARP，procaspase-3，procaspase-9，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9，XIAP，Mcl-1 and Bcl-2 in DLBCL cell line OCI-LY-19.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control(0 μmol/L or 0 h).圖4 SNS-032對(duì)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞株OCI-LY-19凋亡相關(guān)蛋白PARP、procaspase-3、procasepase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、XIAP、Mcl-1和 Bcl-2表達(dá)的影響

4 SNS-032對(duì)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制作用

SNS-032在OCI-LY-19細(xì)胞中呈濃度和時(shí)間依賴性地下調(diào)Akt和STAT5的總蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)，下調(diào)ERK的磷酸化水平，ERK總蛋白未見(jiàn)明顯變化，見(jiàn)圖5。

討 論

DLBCL是成人惡性淋巴瘤中最常見(jiàn)的一型，在形態(tài)學(xué)和臨床表現(xiàn)上都具有顯著的異質(zhì)性，且細(xì)胞多藥耐藥基因顯著表達(dá)，傳統(tǒng)化療藥物治療后預(yù)后很差［1］，新型藥物的研發(fā)迫在眉睫。為此，我們選取了彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞株OCI-LY-19為研究對(duì)象，觀察小分子化合物SNS-032對(duì)其增殖與凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SNS-032可通過(guò)切割PARP，下調(diào)XIAP和Mcl-1表達(dá)及激活caspase-3和caspase-9而誘導(dǎo)OCI-LY-19細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制了與細(xì)胞增殖相關(guān)的JAKs/STATs、MEK/ERK和PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)與活化。據(jù)我們所知，這是首次發(fā)現(xiàn)SNS-032可以有效殺傷彌漫性大B淋巴瘤OCILY-19細(xì)胞。

Figure 5.Effects of SNS-032 on the expression of proliferation-related proteins Akt，p-Akt，ERK，p-ERK，STAT5 and p-STAT5 in DLBCL cell line OCI-LY-19.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 μmol/L or 0 h).圖5 SNS-032對(duì)彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞株OCI-LY-19增殖相關(guān)蛋白Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、STAT5和 p-STAT5表達(dá)的影響

已有報(bào)道證明小分子化合物SNS-032可用于多種腫瘤，如急性粒細(xì)胞性白血?。?］、慢性淋巴性白血?。?］、多發(fā)性骨髓瘤、腸癌、非小細(xì)胞肺癌等［5-6］的治療。國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有關(guān)SNS-032作用于彌漫性大B淋巴瘤的報(bào)道，我們的研究顯示了SNS-032具有明顯的抗DLBCL作用。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們觀察到SNS-032對(duì)能明顯抑制OCI-LY-19細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)OCI-LY-19細(xì)胞凋亡。首先，MTS法顯示，隨著藥物濃度增加，SNS-032對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯增加;再者，加入0.5 μmol/L SNS-032后，PI染色細(xì)胞數(shù)目增多，提示死亡細(xì)胞增多，而Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示用不同濃度SNS-032處理細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度增加，凋亡細(xì)胞增多;目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制為caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而caspase-9與 caspase-3在caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中分別在起始與執(zhí)行上處于核心地位，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟。Caspase-9與caspase-3的活化意味著細(xì)胞凋亡［7］，為此，我們用Western blotting檢測(cè)了caspase-9與caspase-3前體procaspase-3與procaspase-9的表達(dá)情況，結(jié)果顯示兩者前體形式的表達(dá)均隨SNS-032濃度和時(shí)間的增大而減少，而具有DNA損傷修復(fù)作用且為caspase-3的底物PARP［8］也呈劑量與時(shí)間依賴性的增高而被切割，這都顯示了caspase級(jí)聯(lián)通路的活化。文獻(xiàn)報(bào)道，IAPs家族的XIAP、Bcl-2蛋白家族中的Mcl-1和Bcl-2在細(xì)胞中表達(dá)增多時(shí)，細(xì)胞抗凋亡功能增強(qiáng)［9-10］，從結(jié)果來(lái)看，雖然Bcl-2的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，但XIAP和Mcl-1的表達(dá)均隨劑量與時(shí)間依賴性地增大而減少，細(xì)胞抗凋亡功能減弱。以上研究結(jié)果表明，SNS-032能誘導(dǎo)彌漫性大B淋巴瘤OCI-LY-19細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是抑制該類抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時(shí)活化了caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。JAKs/STATs、MEK/ERK和PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡關(guān)系密切，這些通路異?；罨蓪?dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［11-13］。為此，我們檢測(cè)這些通路中的關(guān)鍵蛋白Akt、STAT5、ERK的磷酸化形式及總蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，該類蛋白的總體蛋白及磷酸化形式p-Akt、p-STAT5、p-ERK的表達(dá)隨SNS-032濃度和處理時(shí)間的增加而抑制，并且Akt與STAT5總蛋白的表達(dá)明顯下降，這提示SNS-032抑制 JAKs/STATs、MEK/ERK和 PI3K-Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)與活化，從而導(dǎo)致OCILY-19細(xì)胞增殖受到抑制。而這些通路是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，并且通過(guò)什么樣的方式聯(lián)系，是我們今后需要進(jìn)一步探討的科學(xué)問(wèn)題。SNS-032為 CDK2、7、9的抑制劑，其中 CDK7和CDK9與RNA聚合酶II的磷酸化密切相關(guān)，SNS-032是否參與和OCI-LY-19細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，如XIAP和Mcl-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程，也是我們進(jìn)一步要研究的關(guān)鍵問(wèn)題。

總之，SNS-032通過(guò)抑制細(xì)胞抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制JAKs/STATs、MEK/ERK和 MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)與活化，從而明顯抑制彌漫性大B淋巴瘤OCI-LY-19細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為臨床上彌漫性大B淋巴瘤的藥物治療提供了新的備選小分子化合物與新的思路。

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