呂 磊，胡建鵬，王 鍵， 徐 偉，譚 輝， 張紅梅，王麗娜， 何 玲

近年來，神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)在缺血性腦卒中中的修復作用已引起廣泛關(guān)注［1］。隨著近年分子生物學技術(shù)的發(fā)展和對干細胞研究的深入，使干細胞增殖分化信號途徑與調(diào)控迅速成為揭示干細胞增殖分化分子機制的前沿課題。近年來研究表明Notch信號通路通過“旁側(cè)抑制”機制對NSCs自我更新、增殖和分化進行調(diào)節(jié)［2］。益氣活血法和補腎生髓法是中醫(yī)臨床上治療缺血性腦卒中常用方法。以往我們的研究已證實益氣活血方能促進和調(diào)節(jié)局灶性腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖分化，補腎生髓法及其代表復方具有促進腦缺血后突觸重塑和神經(jīng)細胞軸突的再生作用［3-5］。本實驗采用線栓法大腦中動脈制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，觀察益氣活血方和補腎生髓方對模型大鼠缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)或海馬CA1區(qū)Notch3和Frizzled2 mRNA及蛋白表達的影響，探討其對腦缺血損傷后內(nèi)源性NSCs增殖分化的影響及其作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康SD大鼠32只，南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(蘇)2002-0031，雌雄各半，月齡4個月，體重(280～320)g。

1.2 試劑及儀器 Notch通路PCR芯片購自SABiosciences，Notch3和Frizzled2單克隆抗體、EnVision兩步法試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋公司。ND-1000型微量紫外可見分光光度計為Thermo產(chǎn)品，ABI PRISM 7700 system為美國應用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品，VANOX顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，JD-801形態(tài)學顯微圖像分析系統(tǒng)為南京捷達科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.3 藥物 益氣活血方(腦絡欣通):黃芪30 g，三七10 g，川芎10 g，紅花6 g。補腎生髓方:龜板膠10 g，鹿角膠10 g，金毛狗脊10 g，杜仲10 g。由安徽中醫(yī)藥大學中藥制劑室制備，分別相當于原生藥6.0 kg/L 和2.4 kg/L。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 隨機分為假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)組、益氣活血方(Yiqi-Huoxue prescription，IR+Y)組和補腎生髓方(Bushen-Shengsui prescription，IR+B)組，每組11只。益氣活血方和補腎生髓方取中等劑量(分別為8.54 g/kg和10.25 g/kg)。復制局灶性腦缺血前30 min給藥1次，以后每天灌胃2次。Sham組和IR組按同樣方法予以等量的生理鹽水灌胃，均持續(xù)1周。

2.2 腦缺血再灌注模型復制與神經(jīng)功能障礙評分

采用改良的Longa法［6］制備大鼠大腦中動脈線栓塞模型及進行神經(jīng)功能缺損體征評分。在腦缺血2 h再灌注時進行評分，2～3分者入選，假手術(shù)組僅進行動脈分離。

2.3 取材 分別于腦缺血2 h、再灌注1周后，10%水合氯醛(3.6 mL/kg，ip)麻醉大鼠，每組取3只大鼠，迅速開顱取腦，在冰凍生理鹽水中，取缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)，-80℃冰箱備用，用于實時熒光定量PCR檢測。每組取8只大鼠，打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向內(nèi)快速注入37℃肝素化生理鹽水200 mL，至右心耳流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250 mL，灌流固定30 min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，取大腦，放入相同的固定液中固定1周，脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，從視交叉后2～3 mm左右在有海馬區(qū)域做連續(xù)冠狀切片，切片厚度5 μm，用于免疫組化染色。

2.4 Notch3和Frizzled2 mRNA和蛋白表達的檢測2.4.1 Notch信號通路基因芯片PCR Assay 嚴格按照操作規(guī)程進行，主要包括:腦組織額頂葉皮質(zhì)RNA抽提，DNase I消化RNA樣品(去除其中可能含有的基因組DNA)，RNA純化，紫外吸收測定法檢測RNA質(zhì)量(濃度、純度)，cDNA合成，實時熒光定量PCR檢測Notch3和Frizzled2 mRNA表達水平。

2.4.2 免疫組化染色 采用EnVision兩步法進行免疫組化染色，DAB顯色液顯色，Notch3和Frizzled2抗體稀釋濃度為1∶100，陰性對照采用正常山羊血清替代I抗進行，蘇木素輕度復染。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.0軟件處理，Notch信號通路基因芯片PCR Assay檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算組間mRNA的表達差異，以上調(diào)或下調(diào)倍數(shù) ＞1.5或＜-1.5為差異有統(tǒng)計學意義;免疫組化染色結(jié)果的處理采用南京捷達JD-801圖像分析系統(tǒng)，在相同視野下對Notch3和Frizzled2免疫反應陽性細胞積分吸光度(integral absorbance，IA)進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 2種中藥復方對腦缺血再灌注模型大鼠額頂葉皮質(zhì)Notch3和Frizzled2 mRNA表達的影響

Notch信號通路基因芯片PCR Assay檢測結(jié)果顯示，與sham組比較，IR組Frizzled2 mRNA表達顯著增高(P＜0.05)，Notch3 mRNA 表達無顯著差異(P＞0.05);與IR組比較，益氣活血方組Frizzled2 mRNA表達無顯著差異(P＞0.05)，Notch3 mRNA表達顯著增高(P＜0.05);與IR組比較，補腎生髓方組Frizzled2 mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，Notch3 mRNA無顯著差異(P＞0.05);與益氣活血方組比較，補腎生髓方組Frizzled2 mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，Notch3 mRNA無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

2 2種中藥復方對腦缺血再灌注模型大鼠海馬CA1區(qū)Notch3和Frizzled2蛋白表達的影響

陰性對照組未見Notch3和Frizzled2蛋白表達;sham組動脈分離側(cè)海馬CA1區(qū)可見Notch3和Frizzled2蛋白明顯表達。IR組Notch3蛋白表達明顯增強，主要表達于神經(jīng)細胞胞核，其IA值顯著高于sham組(P＜0.05);兩中藥復方組海馬 CA1區(qū)Notch3蛋白表達增加，其IA值均顯著高于IR組(P＜0.05)，補腎生髓方組IA值顯著高于益氣活血方組(P＜0.05)。IR組Frizzled2蛋白表達明顯增強，主要表達于神經(jīng)細胞胞核和胞漿，其IA值顯著高于sham組(P＜0.05);兩中藥復方組海馬CA1區(qū)Frizzled2蛋白表達降低，其IA值均顯著低于IR組(P＜0.05)，但2 組之間無顯著差異(P ＞0.05)，見圖 1、2和表2。

表1 各組大鼠額葉皮質(zhì)Notch3和Frizzled2 mRNA表達的變化Table 1.Changes of Notch3 and Frizzled2 mRNA expression in the cortex of frontal and parietal lobes of the rats in different groups(n=3)

Figure 1.The expression of Notch3 protein at 1 week in CA1 area of the hippocampus detected by EnVision two-step method(DAB，×400).A:negative control group;B:sham group;C:IR group;D:IR+Y group;E:IR+B group.Positive staining is brown.圖1 EnVision兩步法檢測海馬CA1區(qū)Notch3蛋白的表達

Figure 2.The expression of Frizzled2 protein at 1 week in CA1 area of the hippocampus detected by EnVision two-step method(DAB，×400).A:negative control group;B:sham group;C:IR group;D:IR+Y group;E:IR+B group.Positive staining is brown.圖2 EnVision兩步法檢測海馬CA1區(qū)Frizzled2蛋白的表達

表2 各組海馬CA1區(qū)Notch3和Frizzled2蛋白表達的積分吸光度值Table 2.Integral absorbance(IA)values of Notch3 and Frizzled2 positive cells in CA1 area of the hippocampus after local cerebral ischemia for 2 h followed by 1 week of reperfusion in different groups(mean±SD.n=8)

討 論

腦血管疾病是中老年人的常見病，以高發(fā)病率、高復發(fā)率、高致殘率、高死亡率為特點，已成為當前疾病三大死亡原因之一。本病以腦卒中為主，尤以缺血性腦卒中最為多見，且近年來呈上升趨勢，占卒中80%。卒中后智力障礙與肢體致殘是一嚴重的社會問題和醫(yī)學難題。研究促進大腦功能重組和神經(jīng)再生及其調(diào)節(jié)機制，促進機體功能恢復，對于減少殘疾發(fā)生將是十分有意義的。

中醫(yī)藥在促進中風恢復期神經(jīng)功能恢復、重建方面積累了一定的實踐經(jīng)驗，取得了一些療效，但由于作用機制不明確，使得用藥缺乏規(guī)律性。益氣活血法、補腎生髓法是臨床治療缺血性腦中風常用治法。近年來研究證實，成年動物以及人的神經(jīng)系統(tǒng)中都有NSCs的存在，但絕大部分在體內(nèi)處于靜止狀態(tài)，在損傷等病理條件下可以被激活并增殖、遷移及分化，可能使損傷造成的形態(tài)及功能上的缺失得以恢復。缺血后內(nèi)源性NSCs的激活在腦缺血修復和功能重建中發(fā)揮了積極的作用，為實現(xiàn)腦損傷后的自身修復帶來了希望。Notch信號轉(zhuǎn)導通路作為胚胎發(fā)育過程中十分重要的信號途徑，其相關(guān)分子的表達、運輸和降解等過程受到諸多因素的調(diào)節(jié)，除了配體-受體水平的調(diào)節(jié)之外，尚受到多種蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)［7］。Notch信號家族包括Notch受體、配體及其相應的細胞內(nèi)信號分子，Notch受體激活后誘導的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在調(diào)節(jié)NSCs的增殖分化中起到重要作用。體內(nèi)研究表明，激活的 Notch受體能夠促進NSCs向星形膠質(zhì)細胞分化，抑制其向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞分化［8］。近年來，隨著干細胞分化方面研究的逐步深入，逐漸認識到 Notch信號通路并非孤立存在的，而是處于一個復雜精細的信號網(wǎng)絡之中，與Wnt信號通路在分子水平上存在聯(lián)系，并且二者之間也存在串聯(lián)和互相調(diào)控，其中Frizzled2為兩者共同調(diào)控因子［9］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬Notch3和Frizzled2 mRNA及蛋白表達增加，說明局灶性腦缺血再灌注存在Notch信號通路變化。有研究表明，腦缺血后可以引起海馬CA1區(qū)神經(jīng)干細胞增殖，同時伴隨著Notch信號通路被激活，抑制Notch信號途徑可以增加神經(jīng)元的數(shù)目［10］。益氣活血方和補腎生髓方防治組多能增強Notch3 mRNA及蛋白表達，降低Frizzled2 mRNA及蛋白表達。但2中藥復方也存在差異，在降低Frizzled2 mRNA表達和增強Notch3蛋白表達方面，補腎生髓方比益氣活血方明顯。以往我們的研究已證實益氣活血方能促進大鼠局灶性腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖分化，補腎生髓方具有促進腦缺血后突觸重塑和神經(jīng)細胞軸突的再生作用［3，5］，因此認為2種中藥復方能通過促進Notch信號通路Notch3 mRNA及蛋白表達，抑制Frizzled2 mRNA及蛋白表達，進而影響局灶性腦缺血后NSCs增殖分化及神經(jīng)可塑性，促進腦損傷康復，但Notch信號轉(zhuǎn)導途徑的激活對NSCs增殖與分化及神經(jīng)可塑性結(jié)果的影響尚有待于進一步研究。

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