宋 輝,楊 濤,郭媛媛,李峰敏,董 平,于藝冰,劉 文

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬秦皇島市第一醫(yī)院,1.血液科;2.普外科,河北秦皇島,066000)

慢性髓性白血病(CML)是一種起源于骨髓多能造血干細(xì)胞的骨髓增殖性腫瘤,特征性費城(Ph)染色體和BCR/ABL融合基因是其標(biāo)記性改變,臨床以粒細(xì)胞增多為突出表現(xiàn),伴有乏力、體質(zhì)量下降、脾腫大等癥狀[1]。20世紀(jì)末,臨床主要采用伊馬替尼治療CML,但由于其具有耐藥性,可產(chǎn)生副反應(yīng),且價格昂貴,導(dǎo)致很多患者難以從中獲益。尿多酸肽(CDA-2)是從健康人尿中獲得的具有多種有效成分的抗腫瘤藥物,通過直接作用于異常的甲基轉(zhuǎn)移復(fù)合酶,從而發(fā)揮誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡和分化的作用[2-3]。目前,臨床上多采用CDA-2治療非小細(xì)胞肺癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、原發(fā)性肝癌、大腸癌、腦膠質(zhì)瘤等晚期腫瘤患者,但關(guān)于治療白血病的研究較少。本實驗應(yīng)用不同濃度的CDA-2作用于K562細(xì)胞,通過臺盼藍(lán)拒染法、吖啶橙(AO)熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)分別觀察CDA-2處理前后K562細(xì)胞的增殖及凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 材料

K562細(xì)胞由秦皇島市第一醫(yī)院中心實驗室提供,CDA-2注射液(100 mg/100 mL)購自合肥永生制藥公司,RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京Solarbio公司,胎牛血清(FCS)購自浙江天杭生物科技有限公司,二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司,AO購自美國Sigma公司,AnnexinV-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司,噻唑藍(lán)(MTT)試劑購自美國Amerisco公司,磷酸緩沖液(PBS)由本院實驗室配制。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將K562細(xì)胞復(fù)蘇后按常規(guī)懸浮培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中,培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度、5%CO2。每周傳代2～3次,細(xì)胞密度約105/mL,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗[4]。

1.2.2 藥物的配置及分組:將CDA-2注射液用直徑為0.22 μ m 的濾器進(jìn)行過濾,以RPMI1640培養(yǎng)液倍比稀釋各藥,放入無菌小瓶中備用。依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果分成6組:不加藥的對照組和加不同濃度CDA-2的5個實驗組,CDA-2終濃度分別為 :15.625mg/L 、31.25mg/L 、62.5mg/L、125 mg/L 、250 mg/L 。

1.2.3 細(xì)胞計數(shù)以及活力測定:臺盼藍(lán)拒染法:用75%的酒精清潔細(xì)胞計數(shù)板,每24 h、48 h及72 h收集經(jīng)上述不同濃度藥物處理的K562細(xì)胞,與0.4%臺盼藍(lán)染液按1∶1比例混勻,將細(xì)胞懸液從蓋玻片的邊緣加入,在顯微鏡下計數(shù)4個大方格中的活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù),死細(xì)胞被染成藍(lán)色,而活細(xì)胞拒染。實驗重復(fù)3次,取平均值為最終結(jié)果。細(xì)胞總數(shù)=(實際細(xì)胞數(shù)/4)×104×2×10,計算增殖抑制率,增殖抑制率=(1-加藥組活細(xì)胞總數(shù)/對照組活細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.4 熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài):采用AO單染法 ,取150μ L細(xì)胞懸液 ,予PBS洗滌后離心10 min,加入AO 5 μ L,再次離心 10 min后去上清,取上述染色液1滴,滴在潔凈玻片上,加蓋玻片后立即于400 nm波長的紫外熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法,常規(guī)收集經(jīng)上述 2組K 562細(xì)胞1mL(約106個細(xì)胞),于離心機上以1000 rpm/min的速度離心10 min,棄上清,加入1mL的冷PBS,輕輕震蕩 ,于離心機上以1300 rpm/min的速度離心6 min,棄上清,重復(fù)2次后將細(xì)胞重懸于1 mL Bingding Buffer中,取100 μ L(含細(xì)胞數(shù)約為 105個),加入 AnnexinⅤ-FITC 及PI各 10 μ L,輕輕混勻,避光 ,室溫放置15 min,再加入 Bingding Buffer 400 μ L,1 h 內(nèi)上機檢測。以AnnexinⅤ-FITC為橫坐標(biāo),PI為縱坐標(biāo)描計流式細(xì)胞散點圖。

2 結(jié) 果

2.1 CDA-2對K562細(xì)胞生長的影響

不同濃度的CDA-2作用于K562細(xì)胞24 h后,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞增殖的抑制率由(29.32±0.60)%增加至(77.99±0.25)%(P<0.05);CDA-2作用于K562細(xì)胞48 h后,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞增殖的抑制率由(36.67±0.54)%增加至(87.65±0.50)%(P<0.05);CDA-2作用于K562細(xì)胞72 h后,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞增殖的抑制率由(39.37±1.06)%增加至(98.17±0.82)%(P<0.05),說明CDA-2對K562細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴性。同一濃度的CDA-2(250 mg/L濃度梯度)作用于K562細(xì)胞 24、48、72 h,細(xì)胞增殖抑制率分別為(77.99±0.25)%、(87.65 ±0.50)%、(98.17±0.82)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但CDA-2濃度為62.5 mg/L時,各時間段細(xì)胞增殖抑制率無顯著差異(P>0.05),提示CDA-2在31.25 mg/L以下濃度時,對K562細(xì)胞生長抑制作用較弱。見表1。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

AO熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài):未經(jīng)藥物處理的對照組為正?；罴?xì)胞,圓形,核呈黃綠色均勻熒光,胞質(zhì)呈橘紅色熒光。隨著藥物濃度的增加,可見細(xì)胞體積逐漸變小,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,核呈致密的黃綠色熒光,甚至核固縮成致密團(tuán)塊,可見黃綠色碎片,見圖1。

表1 C DA-2作用于K562細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

表1 C DA-2作用于K562細(xì)胞的增殖抑制率(,n=3)

CDA-2濃度(mg/L) 24 h 48 h 72 h F P 15.625 29.32±0.60 36.67±0.54 39.37± 1.07 151.010 0.0031.250 38.32±0.50 42.95±0.72 48.70± 0.64 137.990 0.0062.500 50.57±0.63 70.90±0.63 78.64±11.52 13.624 0.07125.000 73.52±0.70 80.25±1.02 86.33± 1.12 121.250 0.00250.000 77.99±0.25 87.65±0.51 98.18± 0.81 639.450 0.00

圖1 熒光染色細(xì)胞形態(tài)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

CDA-2作用K562細(xì)胞24 h,早期凋亡細(xì)胞占0.8%,晚期凋亡細(xì)胞占4.3%;作用K562細(xì)胞48 h,早期凋亡細(xì)胞占1.3%,晚期凋亡細(xì)胞占6.8%;作用K562細(xì)胞72 h,早期凋亡細(xì)胞占3.5%,晚期凋亡細(xì)胞占11.5%,提示CDA-2處理K562細(xì)胞,隨著作用時間的延長及藥物濃度的增加,存活細(xì)胞逐漸減少,凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞逐漸增加。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

3 討 論

CML是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,是第一個被證實有特殊獲得性染色體(Ph染色體)異常的腫瘤病,自然病程分為相對隱匿的慢性期,隨后病情在3～5年內(nèi)進(jìn)展迅速,稱為加速期,再隨之可迅速或經(jīng)不長的一段時期進(jìn)入急變期[5],主要治療包括化學(xué)治療、干擾素、各種酪氨酸激酶(TKI)抑制劑、伊馬替尼等藥物及造血干細(xì)胞移植等[6-7]。19世紀(jì)70年代之前,CML被認(rèn)為是一種不可治愈的疾病。近十年來,特異性的靶向藥物TKI及干細(xì)胞移植的廣泛應(yīng)用明顯提高了CML患者的緩解率及生存期,但在提高生活質(zhì)量的同時,其耐藥性及各種不良反應(yīng)也逐漸增加,且價格昂貴[8-10]。

CDA-2又名喜滴克,是從健康人尿中分離、提取和純化得到的含有多種有機酸和多種分子量在6000D以下的多肽組成的無菌水溶液[11]。研究[12-13]證實,CDA-2作為細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑,可直接作用于異常的甲基轉(zhuǎn)移復(fù)合酶,且具有更為廣譜的分化誘導(dǎo)作用,不受相應(yīng)受體的限制,現(xiàn)已成為應(yīng)用前途最為廣闊的藥物之一。CDA-2是中國自主研發(fā)的新型細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑,屬于非細(xì)胞毒性藥物,可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,且毒副作用較低。

本研究通過臺盼藍(lán)拒染法計算細(xì)胞增殖的抑制率,得出CDA-2可抑制K562細(xì)胞增殖,其抑制作用在一定范圍內(nèi)呈劑量和時間依賴性,且CDA-2在31.25 mg/L以下濃度時,對K562細(xì)胞生長抑制作用較弱;AO熒光染色發(fā)現(xiàn),隨著CDA-2濃度的增加及作用時間的延長,K562細(xì)胞出現(xiàn)皺縮變小,核固縮呈均勻的致密物,且細(xì)胞碎片增多;流式細(xì)胞術(shù)顯示,CDA-2處理K562細(xì)胞,隨著作用時間的延長及藥物濃度的增加,存活細(xì)胞逐漸減少,凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞逐漸增加。

綜上所述,CDA-2在體外可抑制K562細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡,減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及痛苦,為CML的治療開辟了一條新途徑。

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