張亮，陳立軍，王亞林，趙立

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]，約30%的患者確診時已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腎癌根治術(shù)后仍有20%～40%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2-3]。無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的5年存活率為50%～95%，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者則降至5%[4]。RCC對放化療不敏感，免疫治療與分子靶向治療的出現(xiàn)為RCC的治療提供了新的途徑。本研究對解放軍307醫(yī)院泌尿外科2009年1月－2011年6月收治的應(yīng)用舒尼替尼(sunitinib，商品名：索坦)聯(lián)合自體樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer，CIK)進(jìn)行治療的27例轉(zhuǎn)移性腎癌患者的資料進(jìn)行分析，初步評價其療效及安全性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 27例轉(zhuǎn)移性腎癌患者中男23例，女4例，年齡34～79歲，平均55.2歲。均行腎癌根治術(shù)，左側(cè)18例，右側(cè)9例，術(shù)后病理示透明細(xì)胞癌23例、混合細(xì)胞癌2例、集合管癌1例、顆粒性細(xì)胞癌1例，病理分級為T1～3N0～1M0。術(shù)后肺部轉(zhuǎn)移17例，肺轉(zhuǎn)移合并骨轉(zhuǎn)移3例，腎上腺轉(zhuǎn)移2例，雙側(cè)腹股溝合并腹膜后轉(zhuǎn)移1例，胸壁轉(zhuǎn)移1例，對側(cè)腎轉(zhuǎn)移合并肺轉(zhuǎn)移1例，肝轉(zhuǎn)移合并顱內(nèi)轉(zhuǎn)移1例，肺部轉(zhuǎn)移合并腹膜后轉(zhuǎn)移1例，每例患者最少有1處可測量病灶(目標(biāo)病灶)。27例患者均于術(shù)后2年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移后即入院治療。所有患者或法定代理人知情并簽署《知情同意書》接受治療，并報醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。入選標(biāo)準(zhǔn)：①腎癌根治術(shù)后患者；②已有轉(zhuǎn)移并至少有1處可測量病灶，即為目標(biāo)病灶；③Karnofsky評分60～90分；④未接受過系統(tǒng)治療；⑤首次靶向、免疫細(xì)胞治療；⑥無明顯過敏體質(zhì)，無嚴(yán)重基礎(chǔ)疾??；⑦愿意配合詢問病史及體檢并能夠理解問卷內(nèi)容。DC和CIK的分離及培養(yǎng)委托解放軍307醫(yī)院腫瘤生物治療中心進(jìn)行。

1.2 外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離 采集患者外周血，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液從單個核細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞。采用生理鹽水洗滌PBMCs 3次，采用無血清培養(yǎng)基懸浮于培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2孵育箱。配制DC完全培養(yǎng)基150ml，含2‰白細(xì)胞介素-4(IL-4)、2‰粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)，其中120ml用于當(dāng)天DC培養(yǎng)，30ml用于第3天DC補(bǔ)液。

1.3 DC細(xì)胞的培養(yǎng)與回輸治療 取貼壁PBMCs，加入事先配好的DC完全培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天添加含2‰IL-4、2‰GMCSF的培養(yǎng)液5ml。第6天細(xì)胞轉(zhuǎn)染入腫瘤抗原并加入促成熟因子、沉默免疫負(fù)調(diào)控基因(inhibition of antigen presentation attenuators，iAPA)因子和4‰腫瘤壞死因子-α(TNF-α，1000U/ml)混合液。第7天收集成熟DC，離心后分裝。1份用生理鹽水洗滌后配制懸液1ml，加入2%人血白蛋白，當(dāng)天回輸，之后分別于第9、11、13天回輸。DC質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如下。①細(xì)胞數(shù)：皮下四位點注射，每個注射點的量為1.5×106個細(xì)胞(0.2ml)；②細(xì)胞形態(tài)分類：回輸細(xì)胞良好；③活細(xì)胞比例：≥95%；④回輸前內(nèi)毒素、細(xì)菌、真菌、支原體檢測應(yīng)為陰性。

1.4 CIK細(xì)胞的培養(yǎng)與回輸治療 取貼壁的PBMCs加入無血清培養(yǎng)基，使CIK培養(yǎng)的初始密度為(1～2)×106/ml；加入1‰ IFN-γ，裝入細(xì)胞培養(yǎng)袋，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第1天添加1‰ CD3單抗及1‰ IL-2，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞生長狀況適量添加含1‰ IL-2的培養(yǎng)液。第6、11天添加或換液，第10、12天取100μl CIK行革蘭染色。第11、13天收集CIK細(xì)胞，洗滌后回輸。CIK質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如下。①細(xì)胞數(shù)：兩次回輸細(xì)胞＞1×109個；②細(xì)胞形態(tài)分類：回輸細(xì)胞良好，淋巴細(xì)胞＞90%；③活細(xì)胞比例：≥95%；④免疫熒光染色：CD3+≥85%，CD8+≥60%，顯示活化良好；⑤回輸前內(nèi)毒素、細(xì)菌、真菌、支原體檢測陰性。

1.5 治療方案 索坦50mg，1次/d，口服。服藥4周，停藥2周(4/2給藥方案)。藥物治療直至腫瘤進(jìn)展或者出現(xiàn)Ⅲ或Ⅳ級不良反應(yīng)需要減量或停藥。減量方案：索坦37.5mg，1次/d，同樣4/2給藥方案，若仍無法糾正不良反應(yīng)則停藥。靶向治療完成一個療程后，以上述方案回輸DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞，間隔6個月后行下一個療程的細(xì)胞免疫治療。

1.6 指標(biāo)觀測及療效評估

1.6.1 療效評估 治療前1周及細(xì)胞免疫治療后2周行影像學(xué)檢查評估療效并在下一個療程結(jié)束后進(jìn)行確認(rèn)，參照RECIST實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)評估療效。①完全緩解(CR)：所有靶病灶消失，無新病灶出現(xiàn)，且腫瘤標(biāo)志物正常，至少維持4周；②部分緩解(PR)：靶病灶最大徑之和減少≥30%，至少維持4周；③疾病穩(wěn)定(SD)：靶病灶最大徑之和縮小未達(dá)PR，或增大未達(dá)PD；④疾病進(jìn)展(PD)：靶病灶最大徑之和增加≥20%，或出現(xiàn)新病灶?？陀^緩解率(ORR)=(CR+PR)/總例數(shù)×100%。疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/總例數(shù)×100%。

1.6.2 生活質(zhì)量評估 以Karnofsky為標(biāo)準(zhǔn)比較治療前1周與細(xì)胞免疫治療后2周患者的生活質(zhì)量[5]。提高大于10分為改善，下降大于10分為惡化，提高或下降少于10分者為穩(wěn)定?？偺岣呗?(改善+穩(wěn)定)/總例數(shù)×100%。

1.6.3 免疫學(xué)評估 于治療前1周及細(xì)胞免疫治療后2周采集患者外周血，采用流式細(xì)胞法檢測其中T淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8和HLA-DR的陽性率，了解治療前后機(jī)體免疫水平。

1.6.4 安全性評估 參考加拿大國家癌癥研究所的常見毒性標(biāo)準(zhǔn)(NCIC-CTC)[6]，隨訪觀察患者在治療過程中的不良反應(yīng)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。無疾病進(jìn)展生存時間(PFS)、總生存時間(OS)和95%置信區(qū)間(CI)估計采用Kaplan-Meier方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 療效觀察 根據(jù)RECIST行療效評估，全部患者均治療超過1個周期，1個周期后評價CR 0例，PR 4例，SD 17例，PD 6例。ORR為14.8%(4/27)，DCR為77.8%(21/27)。隨訪4～25個月，8例患者目前仍在接受聯(lián)合治療，其中1例患者服用索坦第15周時出現(xiàn)了血小板降低，最低為51×109/L，索坦減量后得以糾正；2例患者因索坦減量后仍無法耐受不良反應(yīng)停藥(分別為骨髓抑制和高血壓)；1例患者因自身經(jīng)濟(jì)原因停藥；14例患者疾病進(jìn)展，無疾病進(jìn)展生存時間(PFS)為4.0～19.5個月；10例患者死亡，總生存時間(OS)為6～21個月。全部27例患者中位PFS為16個月(95%CI 12.5～19.5)，中位OS未達(dá)到。

2.2 生活質(zhì)量 以Karnofsky為標(biāo)準(zhǔn)比較治療前1周與聯(lián)合治療后2周患者的生活質(zhì)量，其中4例改善，16例穩(wěn)定，7例惡化。KPS評分總提高率為74.1%(20/27)。

2.3 免疫評估 對27例轉(zhuǎn)移性腎癌患者于治療前及聯(lián)合治療第一個療程后2周分析外周血T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示，經(jīng)靶向及細(xì)胞免疫治療后，CD4+、CD8+和CD3+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較治療前升高(P＜0.05)，而HLA-DR+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

2.4 安全性及不良反應(yīng) 靶向治療期間，1例患者在服用索坦的第15周出現(xiàn)血小板降低，最低為51×109/L，藥物減量至37.5mg、1次/d維持治療。2例患者因索坦減量后仍無法耐受不良反應(yīng)(分別為骨髓抑制和高血壓)停藥，其他不良反應(yīng)均在Ⅰ-Ⅱ級，其中最常見的為乏力、手足綜合征、高血壓、血小板減少、甲狀腺功能減低和中性粒細(xì)胞減少等，經(jīng)對癥治療后可緩解或耐受，不影響后續(xù)治療。細(xì)胞治療期間，5例患者細(xì)胞輸注后出現(xiàn)一過性發(fā)熱反應(yīng)(37.4～38.2℃)，數(shù)小時后均可自行緩解。1例患者出現(xiàn)短暫頭暈，休息后緩解。細(xì)胞回輸后行血常規(guī)、肝腎功檢查，未見明顯變化。

表1 27例聯(lián)合治療患者治療前后外周血T細(xì)胞表型變化(%，s，n=27)Tab.1 Changes of T-cell phenotype in peripheral blood of 27 patients before and after combination treatment (%,, n=27)

表1 27例聯(lián)合治療患者治療前后外周血T細(xì)胞表型變化(%，s，n=27)Tab.1 Changes of T-cell phenotype in peripheral blood of 27 patients before and after combination treatment (%,, n=27)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with before treatment

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3 討 論

腎癌作為一種惡性泌尿系腫瘤，其發(fā)病率在近年持續(xù)攀升，腹腔鏡腎癌根治術(shù)是當(dāng)前治療腎癌的一項基本手段，尤其對于非轉(zhuǎn)移性腎癌是首選方案，但術(shù)后仍有一定的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率，尤其是臨床Ⅱ、Ⅲ期腎癌，術(shù)后50%～70%出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[4]，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的5年存活率為50%～95%，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者存活率則降至5%[2]。由于腎癌細(xì)胞存在多藥耐藥基因-1及其產(chǎn)物P-糖蛋白的過度表達(dá)，因此對化療藥物幾乎普遍抗拒，對放療亦不敏感。既往細(xì)胞因子治療有效率低，不良反應(yīng)重，且大多無法持久。

索坦是三磷腺苷的強(qiáng)效競爭性抑制劑，可抑制多個受體酪氨酸激酶(RTK)，其中某些RTK參與了腫瘤生長、病理性血管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移的過程[7]。索坦的作用靶點包括血小板衍生生長因子受體(PDGFRα和PDGFRβ)、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)、干細(xì)胞因子受體(KIT)、Fms樣酪氨酸激酶-3(FLT3)、1型集落刺激因子受體(CSF-1R)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(RET)[5,8]。

體內(nèi)回輸免疫活性細(xì)胞的過繼免疫療法是目前一種熱門的腫瘤治療方法。CIK兼具T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性殺瘤細(xì)胞的功能，且體內(nèi)外增殖能力強(qiáng)，是一類殺瘤活性和殺瘤譜更強(qiáng)的新型抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞。DC是迄今為止已知體內(nèi)作用最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，其表面高表達(dá)MHC分子和各種共同刺激分子(如CD80和CD86)，可高效增殖活化未致敏T細(xì)胞，有效抵制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。此外，DC還可通過直接或間接方式影響B(tài)細(xì)胞的增殖，活化體液免疫應(yīng)答[9]。DC+CIK細(xì)胞回輸可以直接殺傷腫瘤，亦可間接誘導(dǎo)機(jī)體的自身免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤，調(diào)節(jié)并增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，從而產(chǎn)生持續(xù)的抗腫瘤作用[10]。DC的發(fā)育分化過程伴隨著其由未成熟的前體細(xì)胞向成熟細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，未成熟的DC(immature DC，imDC)與成熟DC(mature DC，mDC)在表型特征以及生物學(xué)功能上都有區(qū)別，imDC的最大特點是在體外可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞特異性低應(yīng)答?？焖偕L的腫瘤會持續(xù)分泌IL-10、VEGF、TGF-β等細(xì)胞因子，使浸潤于其中的DC持續(xù)處于未成熟狀態(tài)，這些存在于腫瘤周圍的未成熟DC不但會誘導(dǎo)機(jī)體對腫瘤產(chǎn)生免疫耐受，而且會促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞定植并分化，誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成。靶向治療聯(lián)合細(xì)胞治療的效果要好于單純靶向治療的原因可能在于靶向藥物(如索坦、索拉菲尼等)同時抑制了多條信號傳導(dǎo)通路，具有抗腫瘤和抗血管生成作用，使腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變，抑制了相應(yīng)趨化因子的產(chǎn)生，使部分imDC成功轉(zhuǎn)變?yōu)閙DC從而發(fā)揮其抗原呈遞功能，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，識別和殺傷腫瘤細(xì)胞；通過分泌C干擾素(IFN-C)等細(xì)胞因子從而抑制腫瘤血管生成；同時激發(fā)免疫記憶保護(hù)，在宿主再次受到腫瘤細(xì)胞攻擊時發(fā)揮保護(hù)作用。腫瘤靶向治療的同時可能也產(chǎn)生免疫治療的作用，因此療效更明顯。

Hwang等[11]回顧性分析了21例使用索坦治療的轉(zhuǎn)移性腎癌患者的臨床療效，中位PFS為13.4個月，中位OS為28.1個月。本組27例轉(zhuǎn)移性腎癌患者經(jīng)靶向藥物聯(lián)合DC+CIK細(xì)胞治療后，中位PFS為16個月，與之前報道相比有所提高，而OS尚未得出，說明聯(lián)合治療可延長患者疾病無進(jìn)展時間；T細(xì)胞CD4+、CD8+和CD3+百分?jǐn)?shù)較治療前明顯提高，而外周血T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+和CD3+是體現(xiàn)患者細(xì)胞免疫情況的重要指標(biāo)。該結(jié)果提示經(jīng)聯(lián)合治療后患者免疫功能得以改善。KPS評分總提高率為74.1%，提示聯(lián)合治療對改善患者生存質(zhì)量也有所幫助。

本組27例聯(lián)合治療的患者中，以Ⅰ-Ⅱ級藥物不良反應(yīng)為主，基本集中在靶向治療期間，以乏力、手足綜合征、高血壓、血小板減少、甲狀腺功能減低和中性粒細(xì)胞減少常見，經(jīng)對癥治療可緩解，與之前索坦的常見不良反應(yīng)報道相符。在免疫治療期間，只有少數(shù)幾例患者出現(xiàn)一過性發(fā)熱和頭暈現(xiàn)象，均能自行緩解。治療過程中僅1例靶向藥物減量，2例最終停藥，提示患者對聯(lián)合治療有著良好的耐受性。

總之，在本研究中，索坦聯(lián)合DC+CIK細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性腎癌的臨床療效較好，并可延長患者的疾病無進(jìn)展時間，提高免疫功能，改善生存質(zhì)量，耐受性較好，可能成為腎癌綜合治療的一條新途徑。

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