賀康洪，林 陽(yáng)，趙文軍，侯佳寧

（1. 沈陽(yáng)軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110026； 2. 沈陽(yáng)軍區(qū)政治部門(mén)診部，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

利咽顆粒是沈陽(yáng)軍區(qū)某醫(yī)院制劑，用于治療因風(fēng)熱郁肺、肺胃蘊(yùn)熱所致咽部紅腫、咽痛、口干舌燥，干咳少痰有顯著療效。由北豆根、麥冬、天冬、桔梗、甘草等中藥組成，其中北豆根為方中君藥。北豆根富含生物堿，總生物堿的含量約為1.7%～2.5%，其中脂溶性生物堿蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿（結(jié)構(gòu)式分別見(jiàn)圖1）的含量最高，具有抗心律失常、抗高血壓、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛消炎多種藥理活性[1－7]，李可強(qiáng)[8]等采用HPLC法測(cè)定了北豆根中粉防己堿和青藤堿的含量，但兩種成分不能同時(shí)測(cè)定，操作復(fù)雜，覃芳[9]和李廣生[10]等進(jìn)行北豆根指紋圖譜研究和北豆根膠囊含量測(cè)定時(shí)，分別對(duì)蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿進(jìn)行測(cè)定，但未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測(cè)定中藥復(fù)方制劑中兩種成分的含量，本方擬同時(shí)測(cè)定該制劑兩種成分的含量，從而為制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Angilent高效液相色譜儀 1100, Chemistatain system工作站（Angilent America），KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，L-200SM 電子分析天平(十萬(wàn)分之一 Shimadzu Corporation Japan)。甲醇、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific),三乙胺（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為重蒸餾水。

利咽顆粒(批號(hào) 20120120，20120226，20120228，20120531，20120819，20120919，20121112，20121122)購(gòu)自沈陽(yáng)軍區(qū)某醫(yī)院；蝙蝠葛對(duì)照品(批號(hào) 111867－201001)和蝙蝠葛蘇林堿對(duì)照品（面積歸一化法測(cè)純度﹥98%），黑龍江省藥檢所實(shí)驗(yàn)室制；藥材飲片購(gòu)自沈陽(yáng)太原街同仁堂藥店。

圖1 蝙蝠葛堿（A）和蝙蝠蘇林堿（B）結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of dauricine (A) and daurisoline (B)

1.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：DiamonsilTMC色譜柱(4.6 mm×25018mm，5 m)；流動(dòng)相A: 0.05%三乙胺水溶液，B: 乙腈，洗脫梯度:0～5 min, 25%～45%B；5～15 min，45%～60%B；15～20 min，60%～80% B；20～25 min，80%～80% B；流速: 1.5 mL·min-1，柱溫: 35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng): 284 nm；進(jìn)樣量: 20 μL。

在擬定的色譜條件下測(cè)定，蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，對(duì)稱(chēng)因子均在0.95～1.05之間。陰性樣品溶液色譜圖顯示在蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿出峰位未見(jiàn)其它色譜峰干擾，典型色譜峰圖見(jiàn)圖2。

1.3 對(duì)照品溶液制備

取蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為 44.24 μg·mL-1和 56 μg·mL-1的蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

1.4 線性關(guān)系考察

精密量取蝙蝠葛堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL和蝙蝠葛蘇林堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1、2、3、4、5 mL，同置10 mL容量瓶中，加為50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對(duì)照品溶液（X:μg·mL-1）)為橫坐標(biāo),分別與其相應(yīng)的蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得2種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（n = 5）分別為：

結(jié)果表明蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿質(zhì)量濃度分別在1.106～8.848 μg·mL-1、5.6～28 μg·mL-1內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

1.5 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備

取利咽顆粒約1.0 g，精密稱(chēng)定，置于圓底燒瓶中，加50%甲醇25 mL，浸泡30 min，稱(chēng)重，超聲處理(功率100 W，頻率50 kHz) 30 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)液用0.45 μm濾膜濾過(guò)即得。

按處方量1 / 10分別稱(chēng)取除北豆根外的其余各味藥材，加入10倍量的水浸泡1 h，回流提取1.5 h，濾過(guò)；殘?jiān)偌尤?0倍量的水，繼續(xù)回流提取1 h，濾過(guò)，合并煎液，濃縮。用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，制成北豆根陰性對(duì)照溶液。

圖2 蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿液相色譜圖Fig.2 Tipycal chromatograms of dauricine and daurisoline in Liyan granules

1.6 精密度試驗(yàn)

取同一混合對(duì)照品溶液,精密量取 20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿面積的RSD分別為1.5 %和0.8 %，表明該方法精密度良好。

1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取利咽顆粒樣品（產(chǎn)品批號(hào)：20120228）約1.0 g，精密稱(chēng)定。按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在0、1、2、4、8、12 h時(shí)測(cè)定，結(jié)果蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿峰面積的 RSD分別為0.7%和1.6%。表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為20120228的利咽顆粒樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿含量的RSD分別為2.0 %和1.3 %。表明重復(fù)性良好。

1.9 回收率試驗(yàn)

取已知含量的利咽顆粒（產(chǎn)品批號(hào)：20120228）9份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入一定量的對(duì)照品，按“2.4”項(xiàng)下方法制成低、中、高3個(gè)濃度的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 利咽顆粒中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的回收率(n = 9)Table 1 Results of the recoveries of daurieine and daurisoline in Liyan granules ( n = 9 )

1.10 含量測(cè)定

取所收集的各批次利咽顆粒，分別按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中2種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 利咽顆粒中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿含量測(cè)定結(jié)果 (μg·g-1，n=3)Table 2 Contents of daurieine and daurisoline in Liyan granules (μg·g-1，n=3)

2 結(jié)果與討論

2.1 供試品溶液制備方法的選擇

考察了浸泡超聲和加熱回流兩種提取方式，比較兩種方法制備的供試品液中兩種成分的峰面積，結(jié)果表明回流效率不高，采用浸泡、超聲30 min作為最終提取方式?？疾炝?30%甲醇-水溶液、50%甲醇-水溶液、70%甲醇-水溶液、100%水和 100%甲醇，不同濃度甲醇-水溶液的提取效率，以及用堿調(diào)節(jié)提取溶劑的pH值，結(jié)果表明50%甲醇-水溶液為提取溶劑測(cè)得兩種待測(cè)成分的含量最高。在提取溶劑中加氨水或氨試液制得供試品溶液未檢出以上兩種成分，表明蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿為非游離生物堿。因此選取50%甲醇-水作為提取溶劑。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)及洗脫程序的選擇

蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的吸收波長(zhǎng)分別在284、282和280 nm[8-10]均有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)也比較了在以上3個(gè)吸收波長(zhǎng)處待測(cè)成分的色譜峰面積，結(jié)果相差很小，以284 nm處峰面積最大?？疾炝说榷群吞荻葍煞N洗脫方法，結(jié)果等度洗脫色譜峰對(duì)稱(chēng)性差，尤其是蝙蝠葛堿拖尾嚴(yán)重，因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm，梯度洗脫為最終檢測(cè)條件。文獻(xiàn)[7]報(bào)道蝙蝠葛蘇林堿見(jiàn)光易分解、不穩(wěn)定，因此對(duì)照品溶液應(yīng)用時(shí)新制，且操作過(guò)程中應(yīng)避光。

3 結(jié) 論

建立了測(cè)定利咽顆粒中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿含量的HLPC方法，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可用利咽顆粒中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿含量的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)8個(gè)批次利咽顆粒中上述兩種成分進(jìn)行了含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)各批次的品中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的含量有差別，但蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的含量均不低于100.0 μg·g-1和200.0μg·g-1。其含量對(duì)藥效學(xué)作用的影響需要進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。

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