包淋斌，鄔向東，瞿明仁* ，劉明珠，鐘啟平

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省高校動物營養(yǎng)重點實驗室，江西 南昌330045;2.江西宜春強微生物科技有限公司，江西宜春336000)

當(dāng)前，在養(yǎng)殖業(yè)和飼料工業(yè)中，由于大量使用或濫用抗生素及獸藥，導(dǎo)致耐藥性、獸藥殘留等問題日益突出，嚴重影響動物性食品的質(zhì)量和安全，國家對動物飼料中添加藥的控制也越來越嚴格。因此，研究、開發(fā)及應(yīng)用無污染、無殘留、無抗藥性的新型微生態(tài)制劑是今后發(fā)展的重要方向［1－2］。乳酸糞腸球菌屬鏈球菌科、腸球菌屬，可與動物腸道中有益微生物群共生，具有改善動物胃腸功能，促進動物生長和提高生產(chǎn)性能等作用［3－6］。不同的生產(chǎn)廠家，由于發(fā)酵工藝、參數(shù)及載體不同，其在腸道的穩(wěn)定性差別很大［7－8］。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)與宜春強微生物科技有限公司共同研制的乳酸糞腸球菌，采用了固體發(fā)酵工藝，并使用了先進的堿性營養(yǎng)物流加、活性顆粒載體以及促培養(yǎng)、包埋保護和冷藏激活等技術(shù)。為探討強微乳酸糞腸球菌在胃腸道的穩(wěn)定，本研究進行了不同pH 值、牛瘤胃液、人工胃液、人工腸液及膽鹽的耐受性研究，旨在為乳酸糞腸球菌在養(yǎng)殖業(yè)和飼料工業(yè)中應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 乳酸糞腸球菌 由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)與宜春強微生物科技有限公司共同研制。乳酸糞腸球菌(Enterococcus faecalis)由前期研究獲得，采用固體發(fā)酵工藝生產(chǎn)，并采用了先進的堿性營養(yǎng)物流加、活性顆粒載體以及促培養(yǎng)、包埋保護和冷藏激活等先進技術(shù)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基、HM(Mueller－Hinton)培養(yǎng)基購自長城生物公司。

1.1.3 膽鹽、人工胃液、牛胃液、人工腸液 牛5 號膽鹽購自江西省醫(yī)藥公司;鹽酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶購自長城生物公司。牛瘤胃液，取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)肉?；氐臉枪芘?人工腸液和人工胃液由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室自行配制。人工胃液配制(pH 值為3 ～4，含胃蛋白酶1%):取胃蛋白酶1. 0 g，濃鹽酸7. 0 mL，氯化鈉2. 0 g，調(diào)節(jié)pH 為3 ～4。人工腸液配制:取磷酸二氫鉀(KH2PO4)6.8 g，加水500 mL 使溶解，用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8;另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 不同pH 值處理乳酸糞腸球菌存活率測定［7－9］取10 g 乳酸糞腸球菌分別加入90 mL 生理鹽水中，用1 mol/L NaOH 調(diào)整pH=2.0、3.0、4.0、5.0、8.0、9.0、10.0 的，混勻于室溫中分別處理30、60、90、120 min。處理后溶液用無菌生理鹽水做10－1、10－2、10－3……10 倍梯度稀釋，在10－5～10－6兩個稀釋度各取0.1 mL，加入無菌平皿;同時取未經(jīng)pH 處理的乳酸糞腸球菌也做10 倍梯度稀釋，取10－5～10－6兩個稀釋度為對照。將溶化后冷卻至50 ℃的MH 培養(yǎng)基迅速傾注平皿，小心混勻。置37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并記數(shù)。以上樣品均重復(fù)3 次以上，以平均數(shù)為準(zhǔn)。

1.2.2 不同膽鹽處理乳酸糞腸球菌存活率測定［7－9］取1 g 乳酸糞腸球菌分別加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的膽鹽溶液各9 mL，混勻于室溫中分別處理30 min、1、2、3 h。處理后溶液用無菌生理鹽水做10－1、10－2、10－3……10 倍梯度稀釋，在10 －5 ～10－6兩個稀釋度各取0.1mL，加入無菌平皿;同時取未經(jīng)膽鹽處理的乳酸糞腸球菌也做10 倍梯度稀釋，取10－5～10－6兩個稀釋度為對照。將溶化后冷卻至50 ℃的MH 培養(yǎng)基迅速傾注平皿，小心混勻。置37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并記數(shù)。以上樣品均重復(fù)2次以上，以平均數(shù)為準(zhǔn)。

1.2.3 人工胃液、牛胃液處理乳酸糞腸球菌存活率測定［7－9］取1 g 乳酸糞腸球菌分別加入人工胃液、牛胃液各9 mL，混勻于室溫中分別處理于1、2、3、4、5 h。處理后溶液用無菌生理鹽水做10－1、10－2、10－3……10 倍梯度稀釋，在10－5～10－6兩個稀釋度各取0.1 mL，加入無菌平皿;同時取未經(jīng)胃液處理的乳酸糞腸球菌也做10 倍梯度稀釋，取10－5～10－6兩個稀釋度為對照。將溶化后冷卻至50 ℃的MH 培養(yǎng)基迅速傾注平皿，小心混勻。置37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并記數(shù)。以上樣品均重復(fù)2 次以上，以平均數(shù)為準(zhǔn)。

1.2.4 腸液處理乳酸糞腸球菌存活率測定［7－9］取1 g 乳酸糞腸球菌加入腸液各9 mL，混勻于室溫中分別處理于2、4、6、8、10 h。處理后溶液用無菌生理鹽水做10－1、10－2、10－3……10 倍梯度稀釋，在10－5～10－6兩個稀釋度各取0.1 mL，加入無菌平皿;同時取未經(jīng)腸液處理的乳酸糞腸球菌也做10 倍梯度稀釋，取10－5～10－6兩個稀釋度為對照。將溶化后冷卻至50 ℃的MH 培養(yǎng)基迅速傾注平皿，小心混勻。置37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并記數(shù)。以上樣品均重復(fù)2 次以上，以平均數(shù)為準(zhǔn)。

1.2.5 存活率計算 乳酸糞腸球菌存活率=處理后活菌數(shù)/未處理活菌數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH 值處理乳酸糞腸球菌存活率

從表1 可見，隨著處理時間的延長，在任何pH 值條件下，乳酸糞腸球菌的存活率都明顯降低。處理30 min 時，以pH 10 最低，以pH=2，9 較高，處理120 min 時，仍是pH =10 時存活率低，以pH =3，8較高?？傮w來看，乳酸糞腸球菌在酸性條件下存活率較高，在強堿(pH=10)條件下耐受性較差。

表1 不同pH 值處理乳酸糞腸球菌存活率Tab.1 The survival rate of Streptococcus faecalis deal with different pH %

2.2 不同膽鹽處理乳酸糞腸球菌存活率

從表2 可見，乳酸糞腸球菌在膽鹽處理后，隨時間延長，存活率均呈下降，在30 min 內(nèi)，存活均比較高;在1 ～2 h 存活率仍然比較高，但處理3 h 后，4 個不同的膽鹽濃度下，存活率明顯下降;而不同濃度來看，隨著膽鹽濃度上升，存活率越低的規(guī)律。0.2% ～0.4%濃度的膽鹽處理乳酸糞腸球菌，對其存活率影響不大，但高濃度(0.5%)膽鹽處理后，對其存活率影響較大。

表2 不同濃度膽鹽處理乳酸糞腸球菌存活率Tab.2 The survival rate of Streptococcus faecalis deal with different concentration of bile salt %

2.3 天然牛瘤胃液、人工胃液處理乳酸糞腸球菌存活率

從表3 可見，乳酸糞腸球菌對天然牛瘤胃液耐受性比較強，處理3 h，存活仍有95%以上。而對人工胃液的耐受性明顯下降，經(jīng)人工胃液處理1 h，存活率就下降到81%;2 h，存活率就僅有61%左右;3 h 后，又有近一半死亡，存活率僅37.93%;4 h 后，存活率不到30%。

2.4 人工腸液處理乳酸糞腸球菌存活率

從表4 可見，乳酸糞腸球菌對人工腸液有一定的耐受性。在2 h 內(nèi)，存活率達98.16%;4 h 存活率仍有72.64%。但4 h 后，存活率明顯下降，8 h 降至40%以下，10 h 后，則降至30%以下。

表3 人工胃液、牛瘤胃液處理乳酸糞腸球菌存活率Tab.3 The survival rate of Streptococcus faecalis deal with artificial gastric juice and ruminal fluid %

表4 人工腸液處理乳酸糞腸球菌活菌含量和存活率Tab.4 The survival rate and lactobacillus content of Streptococcus faecalis deal with artificial intestinal juice %

3 討論與結(jié)論

3.1 乳酸糞腸球菌對pH 值耐受性

通常胃酸pH 值在3.0 左右，流體食物在胃中停留的時間為1 ～2 h，進食后很短時間內(nèi)，胃內(nèi)pH 值可以上升到6.0 左右［10－11］。Kos 等［12］］認為，益生菌通過胃腸道時，食糜作為一種保護劑使益生菌受到傷害的程度減小，一旦在穿越胃和十二指腸中能存活下來，隨同食糜進入回腸、盲腸的細菌會急劇增加。益生菌如能夠耐胃酸低pH 環(huán)境，順利通過胃到達腸道，為發(fā)揮益生菌作用提供了先決條件。閆培芳等［13］比較不同堿性條件對生物膜狀態(tài)糞腸球菌的影響，結(jié)果表明:生物膜狀態(tài)糞腸球菌對堿性環(huán)境具有強的耐受性，pH 值為7 ～9 時，對生物膜狀態(tài)糞腸球菌無明顯影響。本研究表明:乳酸糞腸球菌以pH=2，9 時存活率較高，以pH =10 最低，表明:強微乳酸糞腸球菌對酸性受性更強，對堿性尤其是強堿(pH=10)耐受性較差。與閆培芳等［13］結(jié)果不一致，原因是其使用的乳酸糞腸球菌沒有經(jīng)過包被處理，而本試驗采用的強微乳酸糞腸球菌是經(jīng)過包被處理的，因此其抵御酸的能力增強。

3.2 乳酸糞腸球菌對膽汁、胃液和腸液耐受性

對膽汁、胃液和腸液的敏感性也是篩選益生菌的重要指標(biāo)。對膽鹽、胃液和腸液的耐受是細菌的在宿主腸道中定殖和代謝的前提條件［14］。許光勝等［15］報道，從健康豬直腸內(nèi)容物中分離到NA14 菌株具有較強的耐受人工胃液和耐膽汁的能力。本研究結(jié)果表明:0.2% ～0.4%濃度的膽鹽處理乳酸糞腸球菌，對其存活率影響不大，但高濃度(0.5%)膽鹽處理后，對其存活率影響較大。乳酸糞腸球菌對天然牛瘤胃液耐受性比較強，處理3 h，存活仍有95%以上。而對人工胃液的耐受性明顯下降，經(jīng)人工胃液處理3 h 后，存活率僅37.93%。4 乳酸糞腸球菌對人工腸液的耐受性在2 ～4 h 內(nèi)比較強，存活率仍然達到72.64%。與上述報道相似。

強微乳酸糞腸球菌能耐受較低的pH，對胃液、腸液、膽鹽耐受性較高，故在胃腸道中較穩(wěn)定。

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