汪珍春，王小蘭，鄭毅勝，周伯春，姜立云

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006;2.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

菊花Chysantemum morifolium為多年生草本植物，是經(jīng)長(zhǎng)期人工選擇培育的名貴觀賞花卉，我國(guó)的菊花品種有3000種以上(Li，1981)。菊花因清雅高潔，花型優(yōu)美，顏色絢麗，多被用于花壇、地被、盆花和切花等，是廣州地區(qū)春節(jié)期間主要的上市花卉之一。然而，菊花在生長(zhǎng)過(guò)程中非常容易受到病蟲害的威脅，蚜蟲是其重要害蟲之一(Wang et al.，2002)。蚜蟲不僅危害嫩枝、葉背、花蕾，致使植株矮化、卷葉，甚至死亡(Sauge et al.，2002)，其排泄物還易導(dǎo)致煤污病發(fā)生，同時(shí)也是菊花病毒的主要傳播者之一(圖1)(Li，1981;Ellis et al.，1998)。蚜蟲類Aphidinea 昆蟲隸屬于昆蟲綱Insecta 半翅目Hemiptera，世界已知4700 余種(Remaudière and Remaudière，1997)，中國(guó)蚜蟲類資源豐富，已知種類有1000 余種。蚜蟲體型很小，形態(tài)特征特化或退化，具有復(fù)雜的多型現(xiàn)象，有效的形態(tài)鑒別特征較少(張廣學(xué)和鐘鐵森，1983)。因此僅依據(jù)形態(tài)特征的開(kāi)展的蚜蟲物種鑒定工作中的錯(cuò)誤鑒定和同物異名現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，需要具有扎實(shí)的專業(yè)知識(shí)與豐富經(jīng)驗(yàn)的分類學(xué)者才能準(zhǔn)確鑒定(Foottit et al.，2008;Lee et al.，2011)。DNA 條形碼是應(yīng)用單一基因片段序列來(lái)區(qū)分所有物種的快速物種鑒定方法(Hebert et al.，2003)，可以對(duì)處于各個(gè)發(fā)育階段的生物型——卵、幼蟲、成蟲，或死亡個(gè)體的殘骸進(jìn)行鑒定，并且不受性別二態(tài)性的影響(Floyd et al.，2009)，在蚜蟲鑒定中具有顯著的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用價(jià)值。本研究采集了危害廣州市17個(gè)常見(jiàn)綠化菊花品種的2屬2種蚜蟲，桃蚜Myzus persicae(Sulzer)和棉蚜Aphis gossypii Glover，探討基于線粒體COI基因片段的DNA 條形碼在快速鑒定危害廣州常見(jiàn)菊花蚜蟲中的應(yīng)用，以幫助植保工作者在菊花種植、抗性品系的篩選和害蟲防治等工作中進(jìn)行蚜蟲物種的快速、準(zhǔn)確鑒定。

圖1 蚜蟲對(duì)菊花植物的為害Fig.1 Damage on Chrysanthemum plants by aphids

1 材料與方法

1.1 材料

研究用蚜蟲樣品均采自廣州市常見(jiàn)的17個(gè)菊花品種，共計(jì)43份樣品，涉及2屬2種(樣品信息見(jiàn)表1)。所有蚜蟲標(biāo)本浸泡于75%或95%酒精中，保存于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所國(guó)家動(dòng)物博物館(中國(guó)，北京)。其中，95%酒精浸泡標(biāo)本用于分子實(shí)驗(yàn)，75%酒精浸泡標(biāo)本用于制作玻片標(biāo)本后的形態(tài)鑒定。標(biāo)本由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所鑒定。

表1 本研究所用蚜蟲樣品信息Table 1 List of aphid samples used in this study

(續(xù)上表)

1.2 方法

1.2.1 DNA 粗提、PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

DNA 粗提:用TakaRa 公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2 試劑盒粗提DNA，該試劑盒由MightyAmp DNA Polymerase(1.25 U/μL)和MightyAmp Buffer Ver.2(Mg2+，dNTP plus)組成，可以將血液、動(dòng)植物組織等生體直接加入到反應(yīng)液中進(jìn)行PCR，MightyAmp DNA Polymeras 對(duì)粗提樣品顯示很好的擴(kuò)增能力。因此，本實(shí)驗(yàn)選取浸泡于95%酒精中的體型較大的單個(gè)蚜蟲蟲體，吸干蟲體表面酒精后，用dH2O 漂洗三次，浸泡過(guò)夜。次日更換dH2O 后，保留留約2μL 的dH2O，用研磨杵將蟲體研碎，吸取上清液，即得到單個(gè)蚜蟲DNA 粗提液。

PCR 引物設(shè)計(jì):本研究選用線粒體基因細(xì)胞色素氧化酶I 亞基(COI)基因部分序列作為分子標(biāo)記，其擴(kuò)增引物為常用引物L(fēng)EP－F、LEP－R(Foottit et al.，2008)，用于擴(kuò)增COI 基因3'端約700 bp 的片段。引物信息見(jiàn)表2。

PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增體系為20μL，包括:MightyAmp Buffer Ver.2 10μL，primer1 1μL，primer 2 1μL，DNA 粗提液2μL，MightyAmp DNA Polymerase 0.5μL，dH2O 5.5μL。反應(yīng)條件為98℃變性2 min，98℃變性10 s，54℃退火15 s，68℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物于－20℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):取3μL PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(128 V，10 min)。

擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序:PCR 產(chǎn)物純化后，利用ABI 3730xl 96－capillary DNA 分析儀測(cè)序(Applied Biosystems，USA，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司)。

表2 線粒體COI 序列擴(kuò)增引物信息Table 2 Mitochondrial COI primers used in this study

1.1.2 序列分析和鄰接樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)Seqman 5.01(DNASTAR，Inc.1996)軟件對(duì)雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接、校對(duì)、切去引物得到658bp。應(yīng)用DNAMAN5.2.2(Lynnon Biosoft，Quebec，Canada)軟件檢驗(yàn)是否能正確翻譯蛋白質(zhì)以確保序列的正確性;使用MEGA 5.0(Tamura et al.，2007)對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)，分析核酸組成;通過(guò)DAMBE 程序(Xia and Xie，2001)進(jìn)行序列飽和性分析，以轉(zhuǎn)換、顛換為縱軸，以TN93 模型(Tamura and Nei，1993)校正的距離為橫軸做散點(diǎn)圖;基于 K2P 模型(Kimura－2－parameter distance，Kimura，1980)，計(jì)算序列差異，構(gòu)建鄰接樹(shù)(Neighbour－Joining tree，NJ tree)，并對(duì)各分支節(jié)點(diǎn)進(jìn)行Bootsrap 檢驗(yàn)(檢測(cè)1000 次，每次檢測(cè)隨機(jī)加樣重復(fù)100 次);應(yīng)用EXCEL 軟件(Microsoft Office Excel 2003)計(jì)算各差異頻次，繪制頻次圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI 序列特征及飽和性分析

實(shí)驗(yàn)獲得蚜蟲2屬2種43個(gè)序列，經(jīng)Seqman比對(duì)后得到658 bp，編碼218個(gè)氨基酸。表3 顯示不同密碼子位點(diǎn)的堿基分布，堿基平均含量為39.8%T，14.3%C，35.3%A，10.6%G。A+T 含量為75.1%，C+G 含量為24.9%，存在明顯的A、T 堿基偏好性。其中，有保守位點(diǎn)551個(gè)，可變位點(diǎn)62個(gè)，簡(jiǎn)約位點(diǎn)56個(gè)，單個(gè)突變位點(diǎn)6個(gè)。

應(yīng)用DAMBE 程序?qū)π蛄羞M(jìn)行了飽和性分析，以轉(zhuǎn)換、顛換為縱軸，以TN93 模型校正的距離為橫軸做散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖2 所示，序列間轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)隨距離增加呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，未表現(xiàn)出飽和態(tài)勢(shì)，所以658個(gè)位點(diǎn)都可被用于后續(xù)分析。

表3 樣品中不同密碼子位點(diǎn)的堿基含量分布(%)Table 3 The base content for samples and each codon position

圖2 基于658 bp 線粒體基因COI 的序列飽和性分析散點(diǎn)圖Fig.2 Saturation plots for the mitochondrial COI sequences with 658bp.

2.2 NJ 樹(shù)結(jié)構(gòu)分析

基于COI 序列和K2P 模型，使用鄰接法分析后得到所有樣品的NJ 樹(shù)(圖3)。結(jié)果表明，棉蚜A.gossypii Glover和桃蚜M.persicae(Sulzer)的所有樣品都能各自聚為一支，并有較高的支持率，分別為棉蚜64%，桃蚜為100%。

圖3 基于COI 序列和K2P 模型構(gòu)建的NJ 樹(shù)，自舉檢驗(yàn)支持率標(biāo)在分支左側(cè)Fig.3 Neighbour－Joining(NJ)tree based on COI sequences and Kimura's two parameter model with bootstrap percentages shown on left.

2.3 序列差異分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的2種43 條COI 序列差異進(jìn)行了計(jì)算與統(tǒng)計(jì)，平均差異為2.10%，標(biāo)準(zhǔn)差為4.00%，差異范圍為0.00%～10.3%。主要集中在0.00%～2.50%和10.00%～12.50% 范圍內(nèi)，種內(nèi)序列差異和種間序列差異之間形成了明顯的“Barcoding gap”。種內(nèi)序列差為0.00%～1.20%，平均差異為0.08%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.18%。各物種的種內(nèi)差異見(jiàn)表4。棉蚜A.gossypii 序列間的差異最大，可達(dá)1.20%。種間差異為9.60%～10.30%，平均差異為9.69%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.13%。

圖4 基于線粒體COI 658bp 序列和K2P 距離的種間序列差異頻次圖Fig.4 Histogram of genetic divergence using Mitochondrial COI 658bp Sequences.Divergences were calculated using Kimura's two parameter(K2P)model.

表4 各種種內(nèi)序列差異Table 4 Mean and range of intraspecific nucleotide divergences

3 結(jié)論與討論

本研究收集了廣州市常見(jiàn)綠化菊花17個(gè)品種:黃香梨、黃色秋菊、非洲菊、紅色秋菊、粉色車輪菊、白毛獅子、北京紅、萬(wàn)壽菊、金皇后、紫色車輪菊、黃球菊、虢國(guó)夫人、村姑晨妝、車輪菊、大麗花、翠鳳祥云、墨荷上的2屬2種蚜蟲。其中，棉蚜Aphis gossypii Glover 出現(xiàn)在所有的品種上，多數(shù)寄生于花瓣，少數(shù)寄生于葉背面。桃蚜Myzus persicae(Sulzer)只在墨荷、紫色車輪菊、黃香梨、翠鳳祥云、黃色秋菊上發(fā)現(xiàn)。花瓣、葉背面都有寄生。

Hebert 等(2003)對(duì)包括脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物界的線粒體COI 基因序列分析得出結(jié)論:除腔腸動(dòng)物外，98% 物種的種內(nèi)遺傳距離差異為0.00%～2.00%，種間遺傳距離差異平均可達(dá)11.30%。作為一種新的物種鑒定手段，基于mtDNA COI 基因的條形碼技術(shù)目前在昆蟲鑒定方面有廣泛應(yīng)用，在桔小實(shí)蠅(劉慎思等，2012)、對(duì)齒小蠹屬昆蟲(常虹等，2012)、夜蛾科物種(楊聰慧等，2012)、我國(guó)常見(jiàn)7種蝗蟲(潘程瑩等，2006)、我國(guó)田間常見(jiàn)25種薊馬(喬瑋娜等，2012)以及蚜蟲(Foottit et al.，2008;Lee et al.，2011;Wang et al.，2011;溫娟等，2013;陳睿等，2013)等類群的研究中均顯示出了很高的解決效力。

本研究結(jié)果與其他昆蟲類群的條形碼研究結(jié)果一致。采自廣州市菊花上的2個(gè)蚜蟲物種的COI序列存在明顯的A、T 堿基偏好性，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征(Simon et al.，1994;von Dohlen et al.，2000;Zhang and Qiao，2007a，2007b;Wang et al.，2011;Liu and Beckenbach，1992);種內(nèi)平均差異為0.08%，最大差異為1.20%，種間平均差異為9.69%，最小差異值達(dá)到9.60%，說(shuō)明線粒體COI 基因作為條形碼能有效地區(qū)分蚜蟲的種類，并且能很好地區(qū)分廣州地區(qū)常見(jiàn)的危害菊花的蚜蟲種類。此外，同一個(gè)物種的不同地理種群間的差異很小。例如棉蚜的38個(gè)樣品來(lái)自9個(gè)不同的地理種群，其序列差異僅為0.10%。來(lái)自同一地點(diǎn)，同一寄主的同一器官上的不同樣品也得到了很好的區(qū)分，例如，編號(hào)為wzc090和wzc091 的兩個(gè)樣品(圖1A)都來(lái)自江南大道中的紫色車輪菊的花瓣，經(jīng)形態(tài)鑒定確認(rèn)兩個(gè)樣品分別是棉蚜和桃蚜，它們之間的序列差異達(dá)到9.80%。采自來(lái)自同一地點(diǎn)的同一寄主的不同器官上的兩個(gè)樣品，雖然其體色差異很大，卻為同一個(gè)物種，例如編號(hào)為wzc072(圖1B)和wzc 073(圖1C)的樣品都是采自北京路的黃色秋菊，前者為黑色，寄生于花瓣，后者為墨綠色，寄生于葉背面，但經(jīng)條形碼鑒定都為棉蚜，它們之間的COI 序列差異為0.00。同一品種的菊花在不同地理位置種植，其上寄生的蚜蟲物種也會(huì)不同，例如，種植在珠江以北地區(qū)的天河區(qū)，越秀區(qū)和白云區(qū)的黃香梨上只發(fā)現(xiàn)有棉蚜寄生，而種植在珠江以南的海珠區(qū)的黃花梨則同時(shí)發(fā)現(xiàn)有棉蚜和桃蚜寄生。因此，基于COI 基因的DNA 條形碼可以幫助解決常見(jiàn)危害菊花的不同種蚜蟲易被混淆的問(wèn)題，同時(shí)還可以避免將特征差異較大(例如:體型不等、體色不同)的同種蚜蟲鑒定為不同物種的錯(cuò)誤，在缺乏蚜蟲分類專家指導(dǎo)的前提下，也能夠快速準(zhǔn)確鑒定危害廣州常見(jiàn)菊花的蚜蟲物種，極大地提高了植保工作的效率。

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