譚迎，田迪，賴文巖，郭志剛

流行病學(xué)調(diào)查和動物實(shí)驗(yàn)表明，血漿高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平與心血管疾病發(fā)生風(fēng)險呈高度負(fù)相關(guān)關(guān)系[1]。然而，近年來已有大量研究證實(shí)HDL-C水平高低并不能準(zhǔn)確代表高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)的整體功能，HDL-C水平作為HDL功能的度量標(biāo)準(zhǔn)以及冠心病發(fā)病風(fēng)險的預(yù)測指標(biāo)存在明顯的局限性，對HDL質(zhì)(HDL功能)的關(guān)注較HDL量(HDL-C水平)的關(guān)注更為重要。最新的基礎(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，在急性期反應(yīng)、慢性炎癥以及一些代謝性疾病中，HDL的抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作用減弱，甚至出現(xiàn)致AS作用[2]。急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)發(fā)生時，患者機(jī)體處于一種特殊炎癥及氧化應(yīng)激環(huán)境中，如急性心肌梗死患者體內(nèi)促炎因子趨化因子配體-16(cxc chemokine ligand，CXCL16)較慢性AS患者明顯升高[3]，這種微環(huán)境的改變可能導(dǎo)致HDL結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而使其失去抗AS作用。由此，我們推測ACS的發(fā)生可能導(dǎo)致HDL發(fā)生失功能改變，從而失去正常抗AS作用。本研究通過超高速密度梯度離心分離提取HDL亞組分，比較ACS患者及健康對照人群HDL亞組分的抗氧化功能及抗炎指標(biāo)，明確ACS患者HDL亞組分是否發(fā)生失功能性改變，從而為AS及冠心病的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2011年1月－2012年1月在南方醫(yī)院心內(nèi)科住院的40例ACS患者，作為ACS組。其中，男27例，女13例，年齡51.5±6.2歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合不穩(wěn)定性心絞痛的臨床表現(xiàn)，冠脈造影示至少有一支血管狹窄＞50%，心肌酶譜及肌鈣蛋白升高和(或)心電圖有動態(tài)改變，確診為ACS。排除標(biāo)準(zhǔn)：未控制平穩(wěn)的高血壓、糖尿病、肝腎功能異常、甲狀腺功能異常、腫瘤、自身免疫性疾病、任何急性或慢性炎癥性疾病、甘油三酯≥5mmol/L及體重指數(shù)(BMI)≥30kg/m2、近6周內(nèi)服用調(diào)脂藥物及中成藥。另外，將同期在我院體檢的40例健康體檢者列入對照組。其中，男27例，女13例，年齡49.2±5.0歲。對照組無冠心病及高脂血癥病史，且除外高血壓、糖尿病、肝腎功能異常、甲狀腺功能異常、腫瘤、自身免疫性疾病、任何急性或慢性炎癥性疾病及血脂代謝異常相關(guān)疾病。本研究獲得倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選者均為自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血脂及超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)檢測 抽取兩組人群清晨空腹靜脈血5ml，靜置30min后離心取血清，置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用酶學(xué)終點(diǎn)比色法在全自動生化分析儀上檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及HDL-C濃度；采用透射比濁法檢測血清hsCRP濃度。

1.2.2 HDL亞組分的分離提取 采用Karlsson等[4]兩步非連續(xù)性超高速密度梯度離心方法分離提取HDL亞組分。EDTA抗凝全血20ml，離心后收集血漿并加入EDTA(1mg/ml)和蔗糖(終濃度0.5%)以防HDL氧化和凝集。用0.3816g/ml固體溴化鉀調(diào)整血漿密度至1.24g/ml，取4ml置于規(guī)格為8.9ml的離心管底部，緩慢加入溴化鉀/PBS緩沖液(0.0834g/ml，密度1.063g/ml)，用考馬斯亮藍(lán)著色蛋白(此試管作為分離收集HDL的參考)。超高速離心機(jī)(Beckman L-80，Ti90轉(zhuǎn)子固定轉(zhuǎn)角)290 000×g，15℃離心4h[離心后離心管上層為極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)，中層為HDL2和HDL3]。用注射器穿刺離心管分別抽取HDL2和HDL3，置兩離心管中，再分別緩慢加入溴化鉀/PBS溶液(0.3816g/ml，密度至1.24g/ml)，290 000×g，15℃離心2h(HDL2和HDL3均漂浮于離心管上層)，分別收集上層液體。將兩種液體在含200μmol/L EDTA的PBS液中透析48h，超濾除菌，4℃保存。

1.2.3 HDL亞組分對氧磷酶-1(paraoxonase-1，PON1)活性測定 采用Farid等[5]的乙酸苯酯法檢測PON1活性。取反應(yīng)緩沖液 (CaCl22mmol/L，Tris-HCl 0.1mol/L，pH8.0)1.3ml，加入5mmol/L的乙酸苯酯150μl，于25℃預(yù)溫20min后，加入1:10倍稀釋的HDL亞組分60μg(稀釋液為反應(yīng)緩沖液)反應(yīng)90s，用0.5mol/L EDTA 100μl終止反應(yīng)。采用分光光度計(jì)于270nm波長處測定吸光度(A)值。同時設(shè)立血清對照和底物對照。PON1活性=(A×f×FV×103)/(t×SV×L×ε)。其中A為凈吸光度值，f為標(biāo)本稀釋倍數(shù)，F(xiàn)V為反應(yīng)終體積，t為反應(yīng)時間，SV為樣品體積，L為光徑，ε為摩爾消光系數(shù)，270nm波長時乙酸苯酯的ε=1310L/mol。酶的活性單位定義為：每分鐘催化1μmol乙酸苯酯水解所需的酶量為1U。

1.2.4 HDL亞組分脂氫過氧化物(lipid hydroperoxides，LOOH)含量檢測[6]采用二甲苯酚橙顯色實(shí)驗(yàn)法檢測。取HDL2或HDL3溶液90μl，加10μl硝酸三甲苯酯(TPP，10mmol/L)或甲醇混勻，37℃反應(yīng)30min；加入FOX反應(yīng)液[250μmol/L硫酸亞鐵、100μmol/L 二甲酚橙、25mmol/L H2SO4、4mmol/L 2, 6-二叔丁基對甲酚(BHT)溶于90%甲醇中]900μl，混勻，室溫反應(yīng)30min；室溫下12 000×g離心5min，取上清液測A560值，以加與不加TPP時的A560值之差計(jì)算LOOH含量。

1.2.5 HDL亞組分炎癥指數(shù)檢測[7]采用非細(xì)胞學(xué)法檢測。將2,7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFHDA)溶于新鮮甲醇(終濃度2mg/ml)，室溫下避光孵化30min，制成2,7-二氫二氯熒光黃(DCFH)溶液；將10μl 1-棕櫚酰-2-(5,6-環(huán)氧異前列腺素E2)錫甘油-3-磷酸膽堿(PEIPC)溶液(終濃度為50μg/ml)和含HDL2或HDL3的上清液(先用膽固醇試劑盒測定膽固醇量，膽固醇終濃度為10μg/ml)90μl在黑聚苯乙烯微盤中混合，37℃烤箱孵化1h；再在微盤的每個孔中加入10μl濃度為0.2mg/ml的DCFH溶液混合，37℃烤箱中孵化2h；用熒光分析儀分析熒光強(qiáng)度，如數(shù)值小于1，則判斷HDL顆粒有抗炎作用；如數(shù)值大于1，則有促炎作用(HDL缺乏時，將PEIPC氧化DCFH所形成的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化為數(shù)值1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以s表示，檢驗(yàn)各組變量正態(tài)分布情況，非正態(tài)分布的變量經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后再分析，采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組基本臨床資料比較 與對照組比較，ACS組血清LDL-C水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；此外，ACS組血清hsCRP濃度亦較正常對照組明顯升高(P＜0.01)；而兩組年齡、TC、TG及HDL-C水平比較無明顯差異(P＞0.05，表1)。

2.2 兩組HDL亞組分PON1活性、LOOH含量及炎癥指數(shù)比較 ACS組HDL亞組分PON1活性與對照組比較均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；而ACS組LOOH含量則較對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。ACS組亞組分炎癥指數(shù)與對照組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與同組內(nèi)HDL2相比，ACS組及對照組HDL3的LOOH水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.001)。對照組內(nèi)HDL3炎癥指數(shù)較HDL2明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；而ACS組內(nèi)HDL2和HDL3炎癥指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 ACS組與對照組基本臨床資料比較(Tab. 1 Comparison of basic clinical data between ACS group and control group (

表1 ACS組與對照組基本臨床資料比較(Tab. 1 Comparison of basic clinical data between ACS group and control group (

LDL-C. Low-density lipoprotein cholesterol; HDL-C. Highdensity lipoprotein cholesterol; hsCRP. High-sensitivity C-reactive protein; (1)P＜0.01 compared with control group

Parameter Control group ACS group Age (year) 49.20±5.04 51.50±6.27 Cholesterol (mmol/L) 4.94±0.47 5.12±0.72 Triglycerides (mmol/L) 1.10±0.33 1.16±0.39 LDL-C (mmol/L) 2.96±0.42 3.32±0.65(1)HDL-C (mmol/L) 1.28±0.25 1.22±0.25 hsCRP (lg mg/L) 1.86±0.39 2.79±0.51(1)

表2 兩組HDL亞組分PON1活性、LOOH含量及炎癥指數(shù)的比較Tab. 2 Comparison of HDL subclasses--PON1 activity, LOOH levels and in fl ammatory index between ACS group and control group

3 討 論

HDL作為多功能的蛋白復(fù)合體，其結(jié)構(gòu)和組成成分的改變直接關(guān)系到HDL顆粒的整體功能。當(dāng)體內(nèi)微環(huán)境改變時，可通過改變HDL的組成成分和結(jié)構(gòu)影響HDL的功能。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氧化損傷可損害HDL主要組成蛋白載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，apoA-I)的逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能[8]。有報道，從冠心病患者血漿分離出的HDL中髓過氧化物酶的兩種產(chǎn)物(氯酪氨酸和硝基酪氨酸)均明顯升高，提示氧化損傷可能與HDL失功能改變相關(guān)[9]。

PON1活性和LOOH是評估HDL抗氧化功能的兩個重要指標(biāo)。PON1作為HDL的組成部分，直接參與脂蛋白中過氧化物的水解，防止過氧化物在LDL中聚集，甚至減少氧化型低密度脂蛋白中溶血磷脂的量，進(jìn)而抑制氧化型低密度脂蛋白的生物活性，發(fā)揮血管保護(hù)作用[10]。有研究表明，脂質(zhì)過氧化損傷參與了AS的病理生理過程[8,11]。脂質(zhì)過氧化物L(fēng)OOH作為機(jī)體氧化應(yīng)激發(fā)生時的早期生物學(xué)指標(biāo)，亦可反映HDL的抗氧化功能。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，ACS組患者HDL亞組分PON1活性明顯下降(P＜0.001)，而LOOH水平則較對照組明顯升高(P＜0.001)，ACS組患者HDL亞組分不僅抗氧化功能明顯減弱，甚至可能具有促氧化作用，提示ACS的發(fā)生可損害HDL功能甚至使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兄翧S作用的顆粒。

HDL通過抑制LDL氧化而減輕斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)，以發(fā)揮其抗AS作用。高密度脂蛋白炎癥指數(shù)(high-density lipoprotein in fl ammatory index，HII)可反映HDL的抗炎功能，HII＜1時提示HDL具有抗炎作用，＞1時則有促炎作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性炎癥狀態(tài)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時，AS發(fā)生率升高，并與HII相關(guān)[12]。本研究證實(shí)，在ACS患者，HDL亞組分轉(zhuǎn)變成具有促炎作用的顆粒，這可能與ACS發(fā)生時各種炎性刺激有關(guān)，本研究ACS組血清hsCRP濃度亦較對照組明顯升高(P＜0.001)，間接提示炎癥可能參與了HDL亞組分的失功能改變。炎癥反應(yīng)的加劇可加速AS的進(jìn)展，推測失功能促炎促氧化HDL顆粒的產(chǎn)生可能是加劇AS進(jìn)展的一個重要機(jī)制。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，盡管在ACS組HDL亞組分失去了其正常的抗氧化功能并轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写傺鬃饔玫念w粒，但ACS組和對照組的HDL-C水平并無明顯差異(P＞0.05)，提示HDL功能可獨(dú)立于HDL-C水平成為預(yù)測AS發(fā)生風(fēng)險的又一重要指標(biāo)，同時進(jìn)一步證實(shí)HDL-C水平在預(yù)測AS及CAD發(fā)生風(fēng)險時存在局限性。

HDL亞組分主要由HDL2和HDL3組成，HDL3逐漸成熟成為HDL2，HDL2顆粒較HDL3體積更大但密度則較小，包含有更多的apoA-I，大量研究證實(shí)HDL2較HDL3具有更好的心血管保護(hù)作用，但也有一些專家認(rèn)為，兩者具有同等程度的心血管保護(hù)作用[13]。本研究分別對ACS組及對照組內(nèi)HDL2和HDL3功能進(jìn)行了比較，證實(shí)不論是對照組還是ACS組，LOOH水平在HDL2中均較HDL3中低，且對照組HDL2炎癥指數(shù)亦較HDL3下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ACS組HDL2和HDL3炎癥指數(shù)差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但HDL2炎癥指數(shù)與HDL3比較有降低趨勢。結(jié)果提示，與HDL3相比，HDL2可能具有更強(qiáng)的抗炎、抗氧化功能，從而可發(fā)揮更好的心血管保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)ACS患者HDL亞組分發(fā)生了失功能改變，由具有抗炎、抗氧化作用的顆粒轉(zhuǎn)變成為具有促炎促氧化作用的顆粒，這種亞組分的產(chǎn)生可能是AS及冠心病加劇的一個新機(jī)制；同時，還發(fā)現(xiàn)HDL2較HDL3可能具有更好的心血管保護(hù)作用。HDL-C水平在預(yù)測AS及CAD發(fā)生風(fēng)險時存在局限性，HDL功能的評估有望獨(dú)立于HDL-C水平成為預(yù)測AS發(fā)生風(fēng)險的又一重要指標(biāo)甚至可發(fā)揮更好的預(yù)測作用。

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