陳翔，趙曉

核呼吸因子(nuclear respiratory factors，NRFs)是一類由核基因編碼的能調控線粒體呼吸鏈表達的轉錄因子。作為一類重要的轉錄調節(jié)因子，NRFs在線粒體基因組(mtDNA)及核基因組(nDNA)編碼的呼吸鏈亞基的協(xié)調表達中起著重要作用，參與細胞能量代謝。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元內(nèi)多種基因的表達具有興奮依賴性，且不同的基因在興奮刺激后表達變化的模式各有不同[1-3]。對于體外培養(yǎng)神經(jīng)元，通常采用提高培養(yǎng)液KCl濃度的方法，模擬生理狀態(tài)下神經(jīng)元的去極化狀態(tài)。既往研究發(fā)現(xiàn)，對視皮質神經(jīng)元施加KCl刺激后，神經(jīng)元內(nèi)的NRF-1 mRNA表達增加，撤除刺激后，表達明顯下降，證明NRF-1 mRNA的表達具有興奮依賴性[4]，且神經(jīng)元中NRF-2 mRNA和蛋白表達水平隨細胞色素氧化酶活性的升降而產(chǎn)生相應的同向變化[4-5]。但是，對于采用KCl模擬生理刺激后NRFs表達變化的時間規(guī)律，目前尚無相關報道。為了進一步研究視皮質神經(jīng)元內(nèi)NRFs興奮性依賴性表達的信號通路，進而深入了解正常視覺信號對線粒體功能的調控作用及視力發(fā)育的內(nèi)在機制，本實驗采用原代培養(yǎng)的乳大鼠大腦視皮質神經(jīng)元，施加興奮性刺激(KCl)，在刺激后1、3、5、7、10h收集細胞，行RT-PCR檢測，觀察神經(jīng)元內(nèi)過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子-1 (PPAR γ coactivator-1，PGC-1)、NRFs以及線粒體轉錄因子(mitochondrial transcription factor，mtTFA)基因表達的一系列變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 DMEM、胎牛血清、Neurobasal medium、B-27、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；D-Hanks、L-多聚賴氨酸、Arc-C購自美國Sigma公司；L-谷氨酸、L-谷氨酰胺購自華美生物工程公司；Trizol、DAPI、MitoTracker Red CMXRos購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑購自日本TaKaRa公司；NeuN購自美國Millipore公司；HRP標記羊抗鼠Dako EnvisonTM檢測試劑盒購自美國DAKO公司。SD乳鼠(出生后1d)購自第四軍醫(yī)大學動物實驗中心。

1.2 神經(jīng)元的體外培養(yǎng) 以濃度為25μg/ml的多聚賴氨酸包被無菌塑料培養(yǎng)皿(直徑60mm)，置37℃恒溫孵箱過夜，采用無菌去離子水洗滌3次，每次3min，洗滌后置于孵箱晾干備用。將出生后1d的SD乳鼠經(jīng)75%乙醇消毒，充分麻醉，斷頭處死，沿矢狀線剪開頭皮及顱骨，用解剖鑷將大腦及小腦完整取出，置于預冷的D-Hanks液中，于體視顯微鏡下剝?nèi)ボ浤X膜。視皮質位于大腦枕區(qū)背側面，約2mm×3mm大小，用鋒利手術刀片切除相應區(qū)域，深2～3mm，用纖維剪剪成約1mm3碎組織塊，以上操作均于冰上進行。加入0.25%胰酶浸沒組織塊，于37℃消化10min，移除胰酶，加入含10%FBS的DMEM終止消化，用巴斯德滴管吹打15次左右，靜置，待剩余組織沉淀后，將細胞懸液以105/cm2的密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，3h后全量換液為Neurobasal+B27培養(yǎng)液，24h后在培養(yǎng)液中加入Ara-C(終濃度10μmol/L)抑制膠質細胞生長，按以上方法培養(yǎng)，待神經(jīng)元純度達95%以上時備用。

1.3 KCl干預 采用預先配制好的含KCl(終濃度25mmol/L)的培養(yǎng)液替換原有培養(yǎng)液，在刺激后1、3、5、7、10收集細胞。

1.4 RT-PCR檢測 取原代培養(yǎng)5d的神經(jīng)元，加入Trizol試劑，按說明書提取組織總RNA，使用DRR037S試劑盒行反轉錄。RT-PCR反應以18S RNA作為內(nèi)參照，引物序列如下：NRF-1正向5'-AAAAGGCCTCATGTGTTTGAGT-3'，反向5'-AGGGTGAGATGCAGAGAACAAT-3'，產(chǎn)物大小93bp；NRF-2α正向5'-AGGTGACGAGATGGGCTGC-3'，反向5'-CGTTGTCCCCATTTTTGCG-3'，產(chǎn)物大小604bp；NRF-2β正向5'-CTGTGGATGGTGCAATT CAG-3'，反向5'-GCTGGTGGCTCTTCACTGAT-3'，產(chǎn)物大小112bp；mtTFA正向5'-GAAAGCACAAATCA AGAGGAG-3'，反向5'-CTACTTTTCATCATGAGACA G-3'，產(chǎn)物大小175bp；PGC-1α正向5'-AGTGTGCTG CTCTGGTTGGTG-3'，反向5'-GGAGGGTCATCGTT TGTGGTC-3'，產(chǎn)物大小610bp。PCR反應過程以無cDNA樣品的空白管為陰性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓100V、30min，凝膠成像系統(tǒng)成像，結果經(jīng)Gel-Pro Analyzer 4.5軟件定量分析。檢測重復3次。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SAS 12.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料呈非正態(tài)分布，采用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢驗進行比較，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

KCl刺激后NRFs基因各亞型的表達變化模式各不相同：NRF-1于刺激后3h達高峰，之后表達降低，7h時再次升高達峰值，之后出現(xiàn)下降，呈雙峰形態(tài)。NRF-2α于刺激后持續(xù)升高，至3h達高峰，5h降低，7h再次升高并維持在該水平。NRF-2β在7h達到峰值，其余時間點雖有顯著升高且表達水平相近，但均低于峰值。NRF-1的變化較NRF-2更為顯著(圖1A)。mtTFA的表達于刺激后升高持續(xù)至3h，5h表達降低，7h時再次升高達峰值后出現(xiàn)下降，呈雙峰形態(tài)(圖1B)。PGC-1的表達經(jīng)歷兩次漸進式升高，于10h達到峰值(圖1C)。

3 討 論

NRFs是一類DNA轉錄調節(jié)因子，能激活編碼細胞色素氧化酶及其他呼吸酶各亞基基因的轉錄，促進線粒體增殖，與線粒體能量代謝密切相關，此外，還在機體接受生理刺激、增強能量代謝的過程中起著重要作用。

在NRFs的興奮依賴性研究中，我們提高了細胞培養(yǎng)液KCl的濃度(25mmol/L)，結果發(fā)現(xiàn)，NRFs基因表達在KCl刺激后1h有明顯升高，在觀察時間內(nèi)，表達水平雖有起伏，但均高于對照組，證明神經(jīng)元興奮性增高可使NRFs mRNA表達增高，視皮質神經(jīng)元中NRFs mRNA的表達具有興奮依賴性。同時，興奮引起的NRFs mRNA表達隨時間延續(xù)而變化。NRF-1在細胞中的轉錄和表達水平與細胞的線粒體能量代謝密切偶聯(lián)，呈正相關關系，其轉錄水平增高，線粒體氧化磷酸化功能增強，對體外培養(yǎng)的大鼠視皮質神經(jīng)元，模擬生理刺激時的細胞外液變化(增加神經(jīng)元培養(yǎng)液中KCl濃度)，能使NRF-1蛋白表達增加[4]。其中，在刺激后7h，NRF-1、NRF-2β表達達到峰值，而NRF-2α于刺激后3h達高峰，并與對照組及其前后相鄰時間點有明顯差異，為我們在下一步研究中施加干預因素，闡明NRFs的調控機制奠定了基礎。

圖1 KCl刺激后乳大鼠大腦視皮質神經(jīng)元NRFs(A)、mtTFA(B)和PGC-1(C)mRNA的表達變化Fig. 1 Expressions of NRFs (A), mtTFA (B) and PGC-1 (C) mRNA aた er KCl stimulation in rat's visual cortex neurons

在各基因的表達變化中，以NRF-1在1h時的升高最為明顯，這在一定程度上驗證了如下假設，即NRF-1在外界刺激下的變化較NRF-2α、NRF-2β更為迅速，對外界刺激更加敏感。這也提示我們，視皮質內(nèi)的NRFs具有不同的反應模式，在刺激的應答反應中可能發(fā)揮著不同作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，KCl刺激還能引起與NRFs功能緊密相關的一系列基因的變化[6]，但目前這些基因興奮依賴性調節(jié)的具體時間模式尚無報道。近年來的研究表明，神經(jīng)細胞對外界刺激的應答需要一些特定基因的表達。短暫的刺激與長期的表型變化有著一定的聯(lián)系，這其中需要基因表達的改變，同時也必然存在著一種或多種機制，將細胞表面刺激與神經(jīng)元轉錄調節(jié)裝置偶聯(lián)起來，從而對細胞分化和可塑性發(fā)揮重要作用[7]。本研究對NRFs上游基因PGC-1及下游基因mtTFA mRNA興奮依賴性表達變化進行了觀察，對于我們進一步了解NRFs的調節(jié)機制，及其與相關基因的相互作用具有重要意義，也為我們進一步闡明視覺剝奪性弱視的發(fā)生機制、尋求可能的干預措施提供了依據(jù)。

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