郭俊杰，張素超，趙玉立

(山西省中醫(yī)藥研究院，山西太原 030012)

胰島素抵抗(Insulin resistance)是2型糖尿病的病理生理基礎(chǔ)，貫穿2型糖尿病發(fā)展始終，在胰島素信號通路的各個環(huán)節(jié)均可發(fā)生。中醫(yī)藥在治療糖尿病有較好效果，在改善癥狀和防治并發(fā)癥上有一定的優(yōu)勢，但缺乏對胰島素抵抗作用機理方面的深入研究。本實驗觀察益氣化濁膠囊對胰島素抵抗KKAy小鼠骨骼肌組織內(nèi)胰島素受體底物IRS-1、IRS-2蛋白表達量的影響，進一步從蛋白水平探討其對糖尿病胰島素抵抗的作用機理。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 益氣化濁膠囊由黃芪、黃精、女貞子、蒼術(shù)、蠶繭、丹參、鬼箭羽組成，山西省中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，其中1/2量黃芪以藥材原藥入藥，兼作賦形劑，其余藥味采用水煎煮提取工藝，制成膠囊，批號20 100318;鹽酸吡咯列酮片由北京大洋藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號100301。碘 ［125I］胰島素放射免疫分析藥盒購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號20100913。β-actin(Santa Cruz Biotechnology，1∶1000)，兔抗 IRS-1一抗(Bioworld公司，1∶1000)，兔抗 IRS-2一抗(cell Signling公司，1∶1000)，辣根酶標(biāo)記的抗IgG抗體(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗動物與分組 C57BL/6J小鼠與KKAy小鼠，8～10周齡，雌性，體質(zhì)量25～28 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號SCXK(京)2009-2004。C57BL/6J小鼠8只給予普通飼料，KKAy小鼠予高脂飼料(10%脂肪，10% 蔗糖，基礎(chǔ)飼料)，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，用微量血糖儀(美國強生公司穩(wěn)豪?倍優(yōu)型)連續(xù)兩次測KKAy小鼠血糖，以隨機血糖≥11.1 mmol/L診斷為糖尿病。將符合條件的KKAy小鼠隨機分為4組:模型對照組、陽性對照組(鹽酸吡格列酮)、益氣化濁膠囊高劑量組、低劑量組，每組8只。益氣化濁膠囊高劑量組予益氣化濁膠囊2 g/(kg·d)，臨床用量的20倍;低劑量組予益氣化濁膠囊1 g/(kg·d)，臨床用量的10倍;陽性對照組予鹽酸吡咯列酮2.5 mg/(kg·d)，臨床用量的10倍，正常對照組、模型對照組，以20 mL/(kg·d)給予等容積生理鹽水，灌胃給藥，一日1次，連續(xù)8周。灌胃前將益氣化濁膠囊用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為0.1 g/mL、0.05 g/mL兩種溶液，將鹽酸吡格列酮研成細(xì)粉后用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為0.13 mg/mL的溶液。(給藥量以60 kg/d的人用量計算。)

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 空腹血糖、血清胰島素及胰島素抵抗指數(shù)檢測 實驗動物禁食12 h后，采用微量血糖儀尾靜脈采血直接測空腹血糖，摘除眼球采血用放射免疫分析法測定空腹血清胰島素，計算穩(wěn)態(tài)胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，其計算公式為=空腹血糖胰島素×空腹血糖/22.5［1］。

1.3.2 Western-blot檢測骨骼肌中IRS-1、IRS-2蛋白的表達 取100 mg骨骼肌組織，加入0.5 mL蛋白裂解液，超聲勻漿，離心，取上清，加入等體積的2×SDS buffer離心，收集上清，制備10%的分離膠及5%的濃縮膠，取存骨骼肌組織蛋白上清20μL，電泳約3 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用去離子水沖洗，5%BSA溶液4℃封閉過夜，硝酸纖維素膜放入含有0.1%TBST沖洗2次，先后與一抗抗體、過氧化物酶標(biāo)志的二抗及顯色底物孵育。用ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色，顯影，定影，掃描。用photoshop軟件，計算亮度值，IRS-1、IRS-2蛋白表達水平以IRS-1/β-actin、IRS-2/β-actin 的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 益氣化濁膠囊對KKAy小鼠血糖和胰島素水平的影響與正常對照組比較，模型對照組動物空腹血糖(FPG)、空腹血糖胰島素(FINS)、HOMA-IR顯著升高(P＜0.01);與模型對照組相比，陽性對照組、高劑量組FPG、FINS、HOMA-IR均顯著降低(P＜0.01或 P＜0.05)，低劑量組FPG降低(P＜0.05)(表1)。

表1 各組小鼠FPG、FINS、HOMA-IR水平比較

2.2 骨骼肌IRS-1蛋白的表達與正常對照組比較，模型對照組骨骼肌組織IRS-1蛋白表達量均顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，陽性對照組IRS-1蛋白水平顯著升高(P＜0.01)，益氣化濁膠囊高、低劑量組IRS-1蛋白水平均升高(P＜0.05)。(表2，圖1)

2.3 骨骼肌IRS-2蛋白的表達與正常對照組比較，模型對照組骨骼肌組織IRS-2蛋白表達量均顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，陽性對照組IRS-2蛋白水平升高(P＜0.05)，益氣化濁膠囊高、低劑量組IRS-2蛋白水平均升高，但無統(tǒng)計意義。(表2，圖1)

圖1 IRS-1、IRS-2在骨骼肌組織中的表達

表2 骨骼肌組織中IRS-1、IRS-2蛋白表達水平

3 討論

2008年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)會組織的糖尿病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在20歲以上的人群中，年齡標(biāo)化的糖尿病患病率為9.7%，而糖尿病前期的比例更高達15.15%，成為世界糖尿病患病率增長最快國家之一［2］。研究表明［3］，92%的2型糖尿病患者存在胰島素抵抗，甚至在診斷2型糖尿病前15～20年已經(jīng)存在胰島素抵抗。一項針對5728例受試者口服葡萄糖耐量試驗結(jié)果分析顯示，中國人群空腹血糖受損、葡萄糖耐量異常與胰島素抵抗與胰島素分泌功能的下降均有關(guān)［4］，不同糖耐量人群胰島素抵抗具有空腹血糖越高基礎(chǔ)胰島素抵抗越嚴(yán)重［5］。因此，改善胰島素抵抗已成為2型糖尿病臨床治療的首要問題。

本研究選用與人類的Ⅰ型糖尿病表現(xiàn)極為相似的KKAy小鼠模型作為研究對象，KKAy小鼠是在遺傳易感的的基礎(chǔ)上加環(huán)境因素而誘發(fā)，是一種理想的人類2型糖尿病動物模型［6］。正常對照組選擇與 KKAy小鼠具有基因同源性C57BL/6J小鼠［7］。實驗結(jié)果提示胰島素抵抗模型成立。

現(xiàn)代研究認(rèn)為［8］PI3K/AKT途徑是胰島素信號傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑，IRS作為胰島素性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要信號蛋白，既是胰島素受體酪氨酸激酶的底物，也是胰島素多種生物調(diào)節(jié)作用的中間體，在胰島素抵抗中起重要的作用［9］。IRS-1是最先發(fā)現(xiàn)的胰島素受體底物，其分布廣泛，主要在骨骼肌組織表達，骨骼肌是胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取的關(guān)鍵靶器官之一，在餐后胰島素介導(dǎo)的80%的葡萄糖攝取有骨骼肌完成［10］。IRS-2與IRS-1相對分子質(zhì)量相似，分布廣泛，但主要在肝臟和胰腺 β 細(xì)胞中表達［11］。Rui等［12］報道，延長胰島素的刺激作用能使IRS-1和IRS-2水平明顯下降。王冰等［13］報道胰島素抵抗大鼠肌肉組織中IRS-1 mRNA僅為正常組的47.9%。正常情況下，IRS-1在胰島素信號傳導(dǎo)中起主要作用，而當(dāng)IRS-1受抑制時，IRS-2會成為胰島素受體的主要底物，但IRS-2需要更高濃度的胰島素才能產(chǎn)生作用［14］。當(dāng)IRS-2表達減少時，會導(dǎo)致胰島素作用的減弱，減弱到一定程度時，胰島素信號的細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)即受到阻滯［15］。

臨床使用改善胰島素抵抗的藥物以噻唑烷二酮類為主，但此藥物對肝腎功能異常則禁用并存在水腫、心血管疾病的副作用。本實驗以吡格列酮為陽性對照藥，降糖機制是增加靶細(xì)胞對胰島素作用的敏感性。有實驗證明［16］吡格列酮的胰島素增敏作用可能與IRS-1、IRS-2蛋白的表達的增強有關(guān)。

2型糖尿病胰島素抵抗患者辨證多為氣陰兩虛，瘀濁互阻。中藥復(fù)方益氣化濁膠囊由黃芪、女貞子、蒼術(shù)、丹參、鬼箭羽、黃精、蠶繭組成，諸藥合用標(biāo)本兼治，補瀉兼施，共奏益氣養(yǎng)陰補臟、祛瘀化濁通絡(luò)之功。本研究結(jié)果中，益氣化濁膠囊明顯降低KKAy小鼠FPG，降低HOMA–IR，改善胰島素抵抗;模型組骨骼肌組織中IRS-1、IRS-2蛋白表達水平顯著低于正常對照組，提示骨骼肌中IRS-1、IRS-2蛋白表達的減少可能是2型糖尿病胰島素抵抗的發(fā)病機制之一;陽性對照組骨骼肌組織中IRS-1、IRS-2蛋白表達水平顯著高于模型對照組，證實吡格列酮降血糖，改善胰島素抵抗，與增加骨骼肌中IRS-1、IRS-2蛋白表達有關(guān);益氣化濁膠囊能增高IRS-1蛋白表達，與陽性對照組比較，IRS-2蛋白表達升高不明顯。

從實驗中推測出:益氣化濁膠囊作用機制可能與吡格列酮相似，通過上調(diào)骨骼肌中IRS-1蛋白表達，修復(fù)胰島素信號傳導(dǎo)通路，降低自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠FPG、改善胰島素抵抗，IRS-2在骨骼肌發(fā)揮作用可能需要一定的條件，有待進一步實驗研究。

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