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        雙黃連注射液中半抗原成分酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立

        2013-11-01 03:18:02尹利輝胡昌勤金少鴻
        中成藥 2013年12期
        關(guān)鍵詞:雙黃連包被黃芩

        尹 婕,尹利輝,胡昌勤,金少鴻

        (中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050)

        雙黃連注射液是由金銀花、黃芩、連翹經(jīng)提取精制而成的復(fù)方制劑,具有清熱解毒、疏風(fēng)解表的功效。自1990年上市以來,廣泛用于治療病毒和細(xì)菌引起的感染[1]。1992年被國(guó)家中醫(yī)藥管理局指定為全國(guó)中醫(yī)醫(yī)院急診首批必備中成藥[2]。但隨著臨床的廣泛應(yīng)用,其不良反應(yīng)報(bào)道也日益增多,其中75%系過敏反應(yīng)[3]。特別是近幾年來頻繁出現(xiàn)的嚴(yán)重不良反應(yīng)/事件,使雙黃連注射液作為高風(fēng)險(xiǎn)中藥注射劑品種備受關(guān)注。

        現(xiàn)有研究指出雙黃連注射液中致敏成分的存在是其引起過敏反應(yīng)的主要原因之一[4-5]。但目前對(duì)于致敏物質(zhì)的成分、性質(zhì)仍不明確。文獻(xiàn)報(bào)道雙黃連注射液的過敏反應(yīng)與其組分黃芩苷有直接關(guān)系[6]。有研究表明黃芩苷可作為一種小分子半抗原,刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體[7]。前期的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)黃芩苷能夠特異性地與黃芩提取物免疫獲得的抗血清結(jié)合,即黃芩苷具有反應(yīng)原性。但對(duì)于黃芩苷致敏作用的機(jī)制仍缺乏有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另一方面,黃芩苷具有顯著的抗菌抗病毒作用,是黃芩的主要有效成分,在多種含黃芩藥材的制劑分析中常被作為質(zhì)控的指標(biāo)。因此,有必要對(duì)黃芩苷的致敏性、作用機(jī)制及其致敏的限量進(jìn)行深入研究,并建立靈敏、高效、穩(wěn)定的黃芩苷微量檢測(cè)方法。

        目前常用于黃芩苷檢測(cè)的方法皆為理化分析方法,以HPLC法最常用[8-10]。但由于某些致敏原能夠誘發(fā)過敏反應(yīng)往往取決于其特定的化學(xué)結(jié)構(gòu),即“化學(xué)決定簇”,并且致敏的濃度亦較低,這就要求對(duì)致敏原定性定量檢測(cè)的方法要具備很高的特異性和靈敏度。以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)為代表的免疫分析技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便,且特別適用于大批量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。要建立ELISA法,首先需要相應(yīng)的抗體。因此本實(shí)驗(yàn)首先在體外制備了黃芩苷的完全抗原,免疫家兔獲得針對(duì)黃芩苷的特異性抗體,旨在建立一種雙黃連注射液中半抗原成分的ELISA定量檢測(cè)方法,為進(jìn)一步研究含有黃芩苷的中藥注射劑中致敏性物質(zhì)提供依據(jù)。

        1 材料

        1.1 試劑與儀器 黃芩苷(baicalin,BAL,中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)110715-201016,純度94.0%);黃芩素(baicalein,中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)111595-200905,純度98.5%);連翹苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)110821-201112,純度96.8%);綠原酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)110753-200413,純度100%);黃芩提取物(批號(hào) 200907231Y)。牛血清白蛋白(BSA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、卵清蛋白(OVA)、酪蛋白(Sigma公司);山羊血清、馬血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所);脫脂奶粉、明膠、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Amresco公司);辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(IgG/HRP-Ab,北京索萊寶科技有限公司)。

        XS105電子天平(Mettler Toledo公司);Spectrum Two紅外光譜儀(PerkinElmer公司);Modulyo冷凍干燥機(jī)、Multikan Spectrum酶標(biāo)儀(Thermo公司);DH4000B電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭白兔,雄性,4~5月齡,體質(zhì)量為2.0~3.0 kg,由北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)提供。許可證編號(hào):SCXK(京)2011-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照國(guó)際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 黃芩苷完全抗原(BAL-BSA)的合成與體外鑒定 采用NHS活性酯法將BAL與載體蛋白BSA偶聯(lián)制備完全抗原,偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥后于-20℃保存。分別采用紅外吸收光譜法和MALDITOF-MS 對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定[11]。

        2.2 黃芩苷完全抗原(BAL-BSA)的免疫原性鑒定及酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立

        2.2.1 抗血清的制備 采用混合免疫法以完全抗原BAL-BSA為免疫原,免疫新西蘭兔3只,免疫程序參照文獻(xiàn)進(jìn)行[11]。同時(shí)設(shè)置BAL單獨(dú)免疫組,經(jīng)相同的劑量和程序免疫。用間接ELISA法檢測(cè)所分離的抗血清的效價(jià)。

        2.2.2 抗血清效價(jià)的測(cè)定及間接ELISA法的建立以BAL為包被抗原,采用間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)。以待測(cè)血清的OD450值大于或等于陰性對(duì)照OD450值的2.1倍,且兩者之差大于0.2(即P/N≥2.1且P-N>0.2)時(shí)所對(duì)應(yīng)的血清最大稀釋倍數(shù)作為抗體效價(jià)。

        2.2.2.1 間接ELISA法檢測(cè)條件的優(yōu)化 分別對(duì)包被緩沖液、封閉液以及酶標(biāo)抗體的稀釋度進(jìn)行優(yōu)化篩選。按照陽性與陰性血清OD450值之比(P/N值)最大,且陰性血清及空白對(duì)照的OD450值較低的原則確定條件。

        將包被原BAL、待測(cè)血清和陰性血清分別倍比稀釋,在96孔板上進(jìn)行方陣滴定。選取陽性血清OD450值在1.0左右,陰性血清OD450值0.2左右,且空白對(duì)照OD450值小于0.1的反應(yīng)孔所對(duì)應(yīng)的抗原濃度和血清稀釋度作為最適抗原包被濃度和血清稀釋度。

        2.2.2.2 間接ELISA法的特異性和靈敏度 采用兩種方法考察間接ELISA法的特異性:a)將BAL進(jìn)行倍比稀釋,按照優(yōu)化后的檢測(cè)條件,檢測(cè)免疫血清中抗體的水平;b)分別以金銀花提取物、連翹提取物、刺五加提取物、丹參提取物作為包被原,按照優(yōu)化后的條件檢測(cè)。根據(jù)AOAC標(biāo)準(zhǔn)[12],以陰性均值)加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(sd,n=20)的和)作為本方法的檢測(cè)限,當(dāng)待測(cè)樣品的測(cè)定結(jié)果>+3sd時(shí),判為陽性;<+2sd時(shí),判為陰性。

        將未經(jīng)免疫的陰性血清和免疫后的陽性血清平行進(jìn)行倍比稀釋,按優(yōu)化后的條件檢測(cè)。以陽性血清與陰性血清OD450值之比(P/N)≥2.1的最大血清稀釋度作為檢測(cè)靈敏度。

        2.2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)抗血清的特異性及其交叉反應(yīng)性 采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,分別以黃芩素、連翹苷、綠原酸和黃芩提取物為競(jìng)爭(zhēng)性抗原,考察兔抗血清的特異性和交叉反應(yīng)性。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的操作要點(diǎn)為[13]:將效價(jià)最高的抗血清稀釋為最佳工作濃度的兩倍,以50μL/孔加至BAL包被的酶標(biāo)板中。再分別加入等體積倍比稀釋的競(jìng)爭(zhēng)用抗原溶液,混合均勻。同時(shí)以50μL抗血清稀釋液和等體積的樣品稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn),以100μL樣品稀釋液作為空白對(duì)照。37℃孵育1 h。其他步驟同非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。

        2.3 雙黃連注射液中半抗原成分的檢測(cè) 采用優(yōu)化后的間接ELISA法對(duì)26批雙黃連注射液中的致敏性半抗原成分進(jìn)行檢測(cè)。注射液包被前用10倍濃度的包被液調(diào)節(jié)pH9.6,同時(shí)包被陽性(包被BAL)和陰性對(duì)照(包被液)。根據(jù)AOAC標(biāo)準(zhǔn)判定,只有當(dāng)陽性對(duì)照呈陽性,陰性對(duì)照呈陰性時(shí)實(shí)驗(yàn)才成立。

        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        3.1 黃芩苷完全抗原(BAL-BSA)的體外鑒定經(jīng)紅外吸收光譜分析證實(shí)BAL與BSA偶聯(lián)成功;通過MALDI-TOF-MS估算出偶聯(lián)產(chǎn)物中 BAL與BSA的偶聯(lián)比約為3∶1,可用于免疫動(dòng)物制備相應(yīng)的抗血清[11]。

        3.2 間接ELISA方法的建立

        3.2.1 間接ELISA法各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 考察的幾種常用封閉液中,1%明膠溶液陰性值最低,封閉效果最佳(見圖1);用碳酸鹽緩沖液(CBS,0.05 mol/L,pH 9.6)稀釋包被原BAL,包被效果優(yōu)于磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.2)(見圖2);當(dāng)酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶10000時(shí),P/N最大,且陰性血清及空白對(duì)照的OD值相對(duì)較低,因此二抗的最佳工作濃度確定為1∶10000(見圖3)。

        方陣滴定中固定酶標(biāo)二抗的工作濃度為1∶10000,篩選包被抗原與抗血清的最佳工作濃度及稀釋倍數(shù),結(jié)果見表1。當(dāng)包被原質(zhì)量濃度為100μg/mL,抗血清稀釋倍數(shù)為1∶500時(shí),陽性孔的OD值為0.978,陰性孔OD值較低,P/N最大,且空白對(duì)照孔的OD值小于0.1。因此確定BAL的最適包被質(zhì)量濃度為100μg/mL,抗血清的最適稀釋倍數(shù)為1∶500。

        圖1 封閉液的選擇Fig.1 Optimization of the blocking solution

        圖2 包被緩沖液的選擇Fig.2 Optimization of the coating solution

        圖3 酶標(biāo)二抗工作濃度的選擇Fig.3 Determination of the optimal dilution of goat anti rabbit IgG/HRP-Ab

        表1 方陣滴定實(shí)驗(yàn)中的OD450值(n=3)Tab.1 OD value at 450 nm in square titration(n=3)

        3.2.2 間接ELISA法的特異性和靈敏度 方陣滴定結(jié)果表明隨著BAL包被質(zhì)量濃度的減小,血清中抗體的水平也隨之降低。同時(shí)陽性血清中的抗體水平明顯高于陰性血清(見圖4)。說明經(jīng)完全抗原BAL-BSA免疫后的家兔產(chǎn)生了針對(duì)BAL的特異性抗體,這也證實(shí)了完全抗原BAL-BSA偶聯(lián)成功。分別以黃芩提取物、金銀花提取物、連翹提取物、刺五加提取物和丹參提取物包被,除黃芩提取物外,其他提取物ELISA結(jié)果均為陰性,表明所建立的間接ELISA法檢測(cè)抗BAL抗體具有良好的特異性。

        圖4 間接ELISA法檢測(cè)抗體的靈敏度Fig.4 Sensitivity of detecting antibody in rabbit serum with ELISA

        對(duì)比倍比稀釋的陽性和陰性血清的檢測(cè)結(jié)果,顯示當(dāng)血清稀釋度達(dá)到1∶8000時(shí),P/N值仍大于2.1,說明該方法的靈敏度為1∶8000(見圖4)。

        3.2.3 間接ELISA法的操作程序 以CBS(pH 9.6,0.05 mol/L)為包被液,將BAL稀釋至100μg/mL,100μL/孔,4℃包被過夜;用PBST洗滌后,加入1%明膠溶液37℃封閉2 h;洗滌,用PBST將待測(cè)抗血清按1∶500稀釋,100μL/孔,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照。37℃溫育1 h;洗滌,將酶標(biāo)二抗(IgG/HRP-Ab)按1∶10000稀釋,100μL/孔,37℃孵育1 h;洗滌,加入TMB底物緩沖液,100μL/孔,37℃顯色15 min;每孔加入50μL 2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng);用酶標(biāo)儀記錄450 nm波長(zhǎng)處的OD值。

        3.2.4 抗血清效價(jià)的測(cè)定及黃芩苷完全抗原(BAL-BSA)的免疫原性鑒定 采用上述ELISA反應(yīng)條件,對(duì)完全抗原BAL-BSA免疫后的兔抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。以免疫前血清為陰性對(duì)照,每個(gè)樣品平行設(shè)定三個(gè)復(fù)孔。測(cè)定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示采用所構(gòu)建的完全抗原BAL-BSA免疫的3只家兔均產(chǎn)生了針對(duì)BAL的多抗,這也證實(shí)了BAL-BSA不但具有反應(yīng)原性,同時(shí)具備免疫原性,說明完全抗原BAL-BSA合成成功。由于動(dòng)物個(gè)體差異,3份抗血清效價(jià)各不相同,其中以1號(hào)家兔抗血清的效價(jià)最高,達(dá)到1∶8000。同時(shí)采用BAL單獨(dú)免疫家兔,在相同的免疫條件下,所獲得的抗體效價(jià)僅為1∶500,免疫原性很低。

        表2 不同兔抗血清間接ELISA測(cè)定結(jié)果(OD450)(n=3)Tab.2 OD value at 450 nm by indirect ELISA with different rabbit antisera(n=3)

        3.2.5 抗血清的特異性檢測(cè) 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的結(jié)果表明連翹苷和綠原酸與抗血清無交叉反應(yīng),它們對(duì)BAL與抗血清的結(jié)合均無競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。圖5為黃芩素(圖5-A)和黃芩提取物(圖5-B)與抗血清的交叉反應(yīng)結(jié)果。由圖5可知,OD450值隨著競(jìng)爭(zhēng)質(zhì)量濃度的增加而減小,提示兔抗血清具有BAL特異性。以競(jìng)爭(zhēng)質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以B/B0(競(jìng)爭(zhēng)抗原孔吸收值/標(biāo)準(zhǔn)孔吸收值)為縱坐標(biāo),繪制競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程計(jì)算出黃芩素和黃芩提取物的抑制中質(zhì)量濃度IC50分別為634.2μg/mL、5.85 mg/mL。

        圖5 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)抗血清的特異性Fig.5 Antiserum specificity detected by competitive ELISA

        3.3 雙黃連注射液中半抗原成分的檢測(cè) 對(duì)26批雙黃連注射液采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)方陣滴定的結(jié)果擬合間接ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線,由此計(jì)算陽性樣品中可能的致敏性成分量。固定抗血清的稀釋倍數(shù)為1∶500,以O(shè)D450值對(duì)抗原包被質(zhì)量濃度(μg/mL)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=219.48x-117.21(r2=0.9910),抗原濃度與OD值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性范圍為2.5~100μg/mL;方法的檢出限(+3sd)為0.43μg/mL,定量限+10sd)為 2.52μg/mL。

        間接ELISA法結(jié)果顯示,26批雙黃連注射液樣品中來源于兩個(gè)廠家的3批樣品(S8、S19、S25)檢出微量抗原性成分,其含有量在3.5~4.4μg/mL之間,其余批次樣品測(cè)定結(jié)果均為陰性。同時(shí)對(duì)比26批樣品中黃芩苷的HPLC法測(cè)定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)26批樣品中S25黃芩苷的量最高(7.2 mg/mL),并且同批次樣品在臨床上出現(xiàn)過嚴(yán)重的ADR。

        4 討論

        雙黃連注射液作為第一批接受再評(píng)價(jià)的中藥注射劑品種之一,過敏性休克和過敏樣反應(yīng)是其導(dǎo)致患者死亡的主要原因。作為一種多味藥材的復(fù)方制劑,其所含的植物蛋白、多糖等大分子物質(zhì)具有完全抗原性;其中的一些小分子化合物(如綠原酸、黃芩苷)可作為半抗原與體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合形成完全抗原,使機(jī)體致敏[7,14]。這種藥品本身成分的復(fù)雜性以及引起過敏反應(yīng)的多因素性,導(dǎo)致雙黃連注射液引起的過敏反應(yīng)具有很大的不可預(yù)知性和不確定性?,F(xiàn)有的研究尚不能明確雙黃連注射液的多種成分中,何種成分是主要的致敏原。

        本研究進(jìn)一步明確了雙黃連注射液的半抗原成分——黃芩苷(BAL)的致敏性。采用NHS活性酯法在體外構(gòu)建了BAL與BSA的完全抗原BALBSA,經(jīng)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí):BAL一般不易使機(jī)體致敏,其在與蛋白質(zhì)等大分子載體結(jié)合成為完全抗原后兼具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)、高特異性的抗體。在優(yōu)化了各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上,建立了用于檢測(cè)BAL的間接ELISA法。采用該方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雙黃連注射液中BAL的量、ELISA法檢測(cè)結(jié)果與臨床ADR之間存在一定的相關(guān)性。這與文獻(xiàn)報(bào)道雙黃連注射劑的過敏反應(yīng)與組分BAL有直接關(guān)系一致[6]。同時(shí)對(duì)比分析間接ELISA法和HPLC法的測(cè)定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)兩種方法的結(jié)果存在差異。26批注射液樣品中均含有BAL(>6.0 mg/mL),而間接ELISA法僅檢出3批樣品呈陽性,說明間接ELISA法檢出的抗原性成分并非BAL分子本身,提示雙黃連注射液致敏的主要抗原決定簇與BAL的結(jié)構(gòu)有關(guān),所建立的間接ELISA法可用于檢測(cè)注射液中潛在的與BAL結(jié)構(gòu)相關(guān)的微量抗原性成分。實(shí)驗(yàn)中制備的抗BAL抗體,為BAL免疫試劑盒的開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ),也為后續(xù)深入研究BAL的免疫檢測(cè)及快速檢測(cè)技術(shù)奠定了基礎(chǔ);另一方面,所建立的ELISA法具有一定的通用性,可為進(jìn)一步研究雙黃連注射液或其他組成中含有黃芩或黃芩苷的中藥注射劑(如清開靈注射液、茵梔黃注射液、痰熱清注射液、舒肝寧注射液、銀黃注射液等)中的致敏性物質(zhì)提供依據(jù)。

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