鄭金旺

（上海東富龍科技股份有限公司，上海 201108）

過氧化氫是一種較強(qiáng)的氧化劑，分子具有非對稱的鏈狀結(jié)構(gòu)。過氧化氫分子極易穿透微生物的細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的過渡金屬離子（或其他物質(zhì)）作用，產(chǎn)生羥基自由基，從而攻擊細(xì)菌、霉菌、芽孢及病毒中的酶、核酸等生命大分子物質(zhì)，致使微生物滅活[1]。2001年，過氧化氫被美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）推薦作為滅菌劑對房屋和建筑進(jìn)行消毒[2]。隨后，過氧化氫蒸氣滅菌設(shè)備被開發(fā)并在歐美各國的制藥、生物、醫(yī)療和衛(wèi)生保健等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

隨著中國GMP（2010版）的頒布和實(shí)施，我國制藥行業(yè)對無菌生產(chǎn)的要求不斷提升，真空冷凍干燥機(jī)實(shí)現(xiàn)‘在位滅菌’（Sterilization-in-place，SIP）是凍干機(jī)通過GMP（2010版）認(rèn)證的最基本前提。然而，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前在國內(nèi)運(yùn)營的所有凍干生產(chǎn)線中，約60%的凍干機(jī)不具備SIP的功能。由于過氧化氫蒸氣滅菌工藝具有殺菌作用快速、滅菌能力強(qiáng)、刺激性小、腐蝕性低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的制藥企業(yè)考慮用過氧化氫蒸氣滅菌系統(tǒng)對缺乏SIP的凍干機(jī)進(jìn)行滅菌。

我公司將自主研發(fā)的過氧化氫蒸氣滅菌系統(tǒng)（HPVS V-50）應(yīng)用于Tofflon Lyo-40-CIP凍干機(jī)（不具備SIP功能）進(jìn)行滅菌，其滅菌效果良好。

圖1 過氧化氫蒸氣滅菌系統(tǒng)（HPVS V-50）

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

生物指示劑（嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子，孢子量106）、化學(xué)指示劑、TSB、30% 500 ml過氧化氫溶液、無菌操作臺、記號筆、便攜式過氧化氫氣體濃度探測器（ATi-PortanSen Ⅱ）及手持式溫濕度測量儀（Testo-645）。

1.2 HPVS V-50滅菌器

HPVS V-50滅菌器是由上海Tofflon公司自主研發(fā)的針對密閉區(qū)域進(jìn)行滅菌的過氧化氫蒸氣發(fā)生系統(tǒng)。整個(gè)過氧化氫蒸氣滅菌過程分為泄露測試、預(yù)處理、高速注入、低速注入和通風(fēng)五個(gè)階段。

（1）泄露測試：通過泄露測試以確認(rèn)該系統(tǒng)的密閉性良好。

（2）預(yù)處理：調(diào)節(jié)并控制凍干機(jī)箱體的相對濕度和溫度在設(shè)定參數(shù)范圍內(nèi)。

（3）高速注入：30%的雙氧水被不斷汽化成含有高濃度的過氧化氫氣體的蒸氣。

（4）低速注入：保持過氧化氫足夠的作用時(shí)間和濃度以確保微生物被完全滅活。

（5）通風(fēng)：該階段不再向凍干機(jī)內(nèi)部注入過氧化氫蒸氣，凍干機(jī)箱體內(nèi)部殘余的過氧化氫氣體催化分解成水和氧氣。在本案例中，通過真空空氣置換以排除箱體內(nèi)部的殘余過氧化氫氣體，從而使凍干機(jī)箱體內(nèi)部的過氧化氫氣體濃度低于職業(yè)允許暴露水平（1 ppm）。

1.3 Lyo-40 CIP凍干機(jī)的過氧化氫滅菌

該Lyo-40 CIP凍干機(jī)由Tofflon 公司生產(chǎn)，具有14個(gè)板層，總板層面積為40 m2，干燥箱內(nèi)腔體的體積約11.5m3（2.20 m×2.20 m×2.35 m），具備“在位清洗”（Cleaning-in-place，CIP）功能，不具備SIP功能。

在對凍干機(jī)進(jìn)行簡單改造后，通過Φ38氣體傳輸管道將HPVS V-50滅菌器與凍干機(jī)連接，并形成閉合的氣流循環(huán)回路，如圖1所示。HPVS V-50滅菌器通過充氣管道將過氧化氫蒸氣注入到凍干機(jī)箱體內(nèi)部，然后再通過回氣管道將未充分作用的過氧化氫蒸氣回流到滅菌器中，如此不斷循環(huán)直到滅菌結(jié)束。

圖2 凍干機(jī)與HPVS V-50滅菌器連接示意圖

Lyo-40凍干機(jī)的過氧化氫滅菌循環(huán)參數(shù)是Tofflon公司根據(jù)凍干機(jī)的結(jié)構(gòu)、規(guī)格和溫濕度狀況并通過滅菌工藝開發(fā)程序確定的滅菌參數(shù)，如表1所示。

1.4 滅菌循環(huán)的監(jiān)測與驗(yàn)證

在滅菌過程中，通過HPVS V-50滅菌器的參數(shù)測量系統(tǒng)對凍干機(jī)箱體的壓力、氣流傳遞的管道內(nèi)相對濕度、過氧化氫溶液注入流量、風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)速、氣流傳遞溫度、汽化溫度及過氧化氫氣體濃度等參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測。此外，通過手持式溫濕度測量儀對滅菌初始溫濕度進(jìn)行驗(yàn)證，并通過便攜式過氧化氫氣體濃度探測器對滅菌循環(huán)結(jié)束后的凍干機(jī)箱體內(nèi)部過氧化氫氣體濃度值進(jìn)行確認(rèn)。在滅菌結(jié)束后，將該濃度傳感器放置于過氧化氫濃度驗(yàn)證孔（如圖2的接口7所示）進(jìn)行測量，以確認(rèn)該凍干機(jī)箱體內(nèi)部的過氧化氫氣體的濃度值低于國家規(guī)定的過氧化氫職業(yè)允許暴露水平值（1ppm）。

表1 Tofflon Lyo-40 CIP凍干機(jī)的過氧化氫滅菌參數(shù)

過氧化氫蒸氣滅菌效果的監(jiān)測和驗(yàn)證主要采用化學(xué)指示劑和生物指示劑。通過化學(xué)指示劑在滅菌循環(huán)作用前后的色帶顏色變化，以評定該滅菌循環(huán)的過氧化氫濃度分布和滅菌作用情況。而生物指示劑用來評估過氧化氫滅菌循環(huán)的滅菌效力，并確認(rèn)該滅菌工藝的滅菌效果達(dá)到無菌保證水平（SAL）。該生物指示劑是由載有孢子數(shù)約為106的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的不銹鋼載片和Tevek包裝組成。

滅菌效果的監(jiān)測和驗(yàn)證過程：在每個(gè)滅菌循環(huán)運(yùn)行前，將已編號的化學(xué)指示劑和生物指示劑放置于凍干機(jī)箱體內(nèi)部相應(yīng)的滅菌挑戰(zhàn)位點(diǎn)（如圖3所示），然后運(yùn)行滅菌循環(huán)，在滅菌循環(huán)完成后，將指示劑其逐個(gè)取出，記錄化學(xué)指示劑的監(jiān)測結(jié)果，而將生物指示劑經(jīng)過無菌操作置于放入對應(yīng)編號的TSB培養(yǎng)基中，然后將其置于在55℃～60℃條件下培養(yǎng)7天后觀察生物指示劑培養(yǎng)結(jié)果。培養(yǎng)基保持紫色不變，則視無菌生長；同時(shí)陽性對照培養(yǎng)基由紫色澄清液體變?yōu)辄S色渾濁即表示合格。連續(xù)運(yùn)行三次該滅菌循環(huán)以確認(rèn)該滅菌工藝的可重演性。

圖3 BI/CI測試位點(diǎn)圖

2 結(jié)果

由于監(jiān)測位點(diǎn)的不同及滅菌循環(huán)的差異，化學(xué)指示劑受過氧化氫作用的程度都有所不同，造成化學(xué)指示劑監(jiān)測效果的差異。為了較好地統(tǒng)計(jì)和說明化學(xué)指示劑對過氧化氫滅菌工藝的監(jiān)測效果，我們將測試后的化學(xué)指示劑的變色的程度進(jìn)行分類以區(qū)分。其中，將經(jīng)歷一個(gè)完整的滅菌循環(huán)作用后，色卡顏色為紫藍(lán)色的化學(xué)指示劑標(biāo)記為A；而受過氧化氫作用程度較差，有一定變色（深灰色）的化學(xué)指示劑標(biāo)記為B；將受過氧化氫作用程度適中但未完全呈現(xiàn)米黃色的化學(xué)指示劑標(biāo)記為C；最后，將色卡顏色為米黃色的化學(xué)指示劑標(biāo)記為D。如表2所示，3次滅菌循環(huán)的每個(gè)滅菌循環(huán)的32個(gè)監(jiān)測位點(diǎn)的CI均由紫藍(lán)色變成米黃色，說明該滅菌工藝的過氧化氫氣體分布較均勻。然而，凍干機(jī)箱體底部（除#12位點(diǎn)外，#11～#14）及凍干機(jī)箱體側(cè)壁的中心區(qū)域（#6～#9）的過氧化氫指示劑變色程度較其他位點(diǎn)要明顯一些，說明這些位點(diǎn)或區(qū)域較其他位置受過氧化氫作用程度要充分一些。

除臭規(guī)?？傦L(fēng)量Q為13 000 m3/h，共計(jì)2套處理系統(tǒng)，其中，一期設(shè)計(jì)風(fēng)量9 000 m3/h，二期設(shè)計(jì)風(fēng)量4 000 m3/h，除臭工藝采用生物土壤濾池除臭技術(shù)。首先將O池中的惡臭氣體密封加蓋，防止惡臭氣體外溢，采用不銹鋼收集風(fēng)管進(jìn)行收集，通過引風(fēng)機(jī)將惡臭氣體引至生物土壤濾池進(jìn)行處理，處理后的氣體無組織達(dá)標(biāo)排放。

表2 化學(xué)評估-CI測試結(jié)果

表3 BI培養(yǎng)結(jié)果

表4 #27位點(diǎn)-微生物挑戰(zhàn)測試結(jié)果

如表3所示，除第2次滅菌循環(huán)的#27位點(diǎn)外，經(jīng)歷三次連續(xù)的滅菌循環(huán)的所有滅菌監(jiān)測生物指示劑的培養(yǎng)結(jié)果皆為陰性。在第2次滅菌循環(huán)的位點(diǎn)#27處（即從上至下的第2個(gè)板層中心）的BI培養(yǎng)結(jié)果顯示為陽性。

第2次滅菌循環(huán)的#27位點(diǎn)出現(xiàn)陽性結(jié)果，可能是因?yàn)樵谏镏甘緞┡囵B(yǎng)操作過程中驗(yàn)證人員操作不慎造成該位點(diǎn)的指示劑培養(yǎng)出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果；也可能是在第2次滅菌循環(huán)#27位點(diǎn)的生物指示劑為Rogue BIs[3]，由于Rogue BIs的細(xì)菌孢子結(jié)塊或簇積從而使該生物指示劑呈現(xiàn)更強(qiáng)的滅菌抗性，造成滅菌失敗。隨后，我公司在#27位點(diǎn)再放置3個(gè)生物指示劑并重復(fù)運(yùn)行3次上述滅菌循環(huán)，以此對該位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)。#27位點(diǎn)的微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)生物指示劑培養(yǎng)結(jié)果，如表4所示，該位點(diǎn)的挑戰(zhàn)生物指示劑連續(xù)經(jīng)歷3次該滅菌循環(huán)未出現(xiàn)有菌生長。

此外，在應(yīng)用安全性方面，我公司用過氧化氫濃度探測儀對HPVS V-50滅菌器設(shè)備周圍環(huán)境及凍干機(jī)內(nèi)部的殘留濃度進(jìn)行測量。結(jié)果如表5所示，在滅菌過程中，HPVS滅菌器周圍環(huán)境中的過氧化氫氣體的濃度低于1ppm；在每次滅菌循環(huán)結(jié)束后，凍干機(jī)箱體內(nèi)部的過氧化氫濃度都低于1ppm。說明該滅菌系統(tǒng)的密閉性良好；并且在滅菌循環(huán)結(jié)束后，凍干機(jī)箱體內(nèi)部過氧化氫氣體已經(jīng)排盡。

表5 過氧化氫滅菌安全監(jiān)測結(jié)果

總之，對過氧化氫蒸氣滅菌工藝的滅菌效果監(jiān)測和驗(yàn)證可知，凍干機(jī)應(yīng)用過氧化氫蒸氣進(jìn)行滅菌的滅菌效果良好。應(yīng)用HPVS V-50過氧化氫蒸氣滅菌器對Tofflon Lyo-40-CIP凍干機(jī)進(jìn)行滅菌對人和環(huán)境沒有造成危害。此外，在滅菌循環(huán)結(jié)束后，凍干機(jī)箱體內(nèi)部沒有產(chǎn)生過氧化氫殘留，過氧化氫氣體濃度低于職業(yè)允許暴露水平值（1ppm）。

3 討論

目前國內(nèi)制藥企業(yè)正在使用的真空冷凍干燥機(jī)絕大多數(shù)不具備在線蒸汽滅菌系統(tǒng)。凍干機(jī)改造添加SIP系統(tǒng)需要滿足以下條件：

（1）凍干機(jī)按D類壓力容器進(jìn)行設(shè)計(jì)和制造，并備有壓力容器設(shè)計(jì)檢測證書和備案證書；

（2）該凍干機(jī)的熱循環(huán)系統(tǒng)使用硅油作為導(dǎo)熱油；

然而，國內(nèi)大多數(shù)凍干機(jī)不能滿足上述條件，通過給不具備SIP功能的凍干機(jī)配備過氧化氫蒸氣滅菌系統(tǒng)，通過充氣管道和回氣管道將滅菌器與凍干機(jī)連接并形成氣流閉合回路，即可使凍干機(jī)實(shí)現(xiàn)“在位滅菌”。

凍干機(jī)內(nèi)部復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（CIP清洗管道、擱板、蘑菇閥和冷凝盤管等部件）影響過氧化氫蒸氣的分布和擴(kuò)散，合理的過氧化氫氣體傳輸以及較好的過氧化氫擴(kuò)散方案較為重要。利于過氧化氫蒸汽的擴(kuò)散的CIP管道布置、避免在過氧化氫蒸氣傳輸過程中熱量過度的損失、凍干機(jī)前后箱底面的斜面排水優(yōu)化設(shè)計(jì)、在凍干機(jī)滅菌過程中實(shí)行分段滅菌和真空氣流置換等措施都有利于凍干機(jī)充分滅菌。

在凍干機(jī)的滅菌驗(yàn)證過程中，通過確立凍干機(jī)滅菌最不利位點(diǎn)（Worst case location）、使用更多的指示劑及添加更多的監(jiān)測位點(diǎn)都能較全面地對該滅菌工藝進(jìn)行驗(yàn)證和評估。

總之，規(guī)范的滅菌工藝、科學(xué)有效的滅菌監(jiān)測和驗(yàn)證、嚴(yán)格的無菌控制和保障，成為當(dāng)前我國無菌制劑生產(chǎn)滿足國內(nèi)外市場日益增高的質(zhì)量訴求和認(rèn)可的首要前提?，F(xiàn)代中國制藥行業(yè)高速發(fā)展并日漸成熟，凍干機(jī)實(shí)現(xiàn)在位滅菌已勢不可擋，越來越多的真空冷凍干燥機(jī)通過簡單改造配置過氧化氫蒸氣發(fā)生系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)“在位滅菌”。我們相信過氧化氫蒸氣滅菌工藝因其低溫、快速、易驗(yàn)證、無毒及環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)將會在制藥行業(yè)有更大的發(fā)展。

[1] 袁勤生. 超氧化物歧化酶[M].上海：華東理工大學(xué)出版社，2009：209-210.

[2] Andrew M. McAnoy. Vaporous Decontamination Methods:Potential Uses and Research Priorities for Chemical and Biological Contamination Control[M].Australia：Australian Government Department of Defence，2006.

[3] James E.Akers. Acceptance Criteria In the Validation of VPHP Decontamination[R].A3P 22nd Congress, October 2010.