趙新節(jié)，史濤濤，張漢波，秦邵智，3，張家榮

1(山東輕工業(yè)學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南，250353)

2(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明，650091) 3(德欽梅里酒業(yè)，云南 德欽，674500)

葡萄酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物反應(yīng)過程，包含了不同酵母群體和數(shù)量的演替。有研究表明，酵母菌群的差異和組成會(huì)明顯地影響葡萄酒的感官特征［1-3］。同時(shí)，文獻(xiàn)中提到，在自然發(fā)酵的初級(jí)階段，葡萄表面某些細(xì)尖的非釀酒酵母為優(yōu)勢(shì)菌種［4-5］，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乙醇濃度的升高，釀酒酵母主導(dǎo)整個(gè)發(fā)酵過程［6］。

很多學(xué)者采用不同地區(qū)以及不同品種的釀酒葡萄進(jìn)行野生酵母的研究。其中包括Sipiczki 等人分析了匈牙利Tokaj 酒廠環(huán)境中自然發(fā)酵條件下分離到的酵母類型［7］，Sipiczki 等人對(duì)匈牙利Aglianico 葡萄自然發(fā)酵過程中的野生釀酒酵母進(jìn)行遺傳分離的研究［8］，Antonella 等人對(duì)意大利的Aglianico，F(xiàn)iano，

Trebbiano，Malvasiaand，Grechetto，Malvasiadelle Lipari，Inzolia 葡萄自然發(fā)酵過程中出現(xiàn)的野生酵母資源進(jìn)行了相關(guān)的鑒定［9-12］，MillaAlves 等人對(duì)巴西葡萄園中與Isabel，Bordeaux 葡萄相關(guān)的野生酵母進(jìn)行分離和分子鑒定［13］，Barbara Bre?ná 等人評(píng)估了捷克斯洛伐克與釀酒有關(guān)的酵母菌群的多樣性［14］，Demuyter 等人發(fā)現(xiàn)葡萄汁酵母連續(xù)3 年為法國阿爾薩斯酒廠的優(yōu)勢(shì)菌種［15］，Van Keulen 等人研究了美國伊利湖畔的Chardonnay，Pinot Gris 和Riesling 品種在自然發(fā)酵過程中存在的酵母類型［16］，澳大利亞的學(xué)者Yap 等人報(bào)道了致死性非釀酒酵母存在的概率［17］，Combina 等人對(duì)來自阿根廷3 個(gè)不同地區(qū)的Malbec 葡萄品種在自然發(fā)酵過程中酵母菌株的消長進(jìn)行了研究［18］。但是，尚未見關(guān)于冰葡萄自然發(fā)酵過程中酵母動(dòng)態(tài)變化的報(bào)道。

本文采用形態(tài)學(xué)與分子生物技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)冰葡萄自然發(fā)酵過程中的酵母進(jìn)行鑒定，探明了德欽產(chǎn)區(qū)與冰酒相關(guān)的野生酵母的種群多樣性，并為利用本土優(yōu)良酵母資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄品種:赤霞珠;果實(shí)樣品:冰葡萄;采摘地點(diǎn):云南省德欽縣瀾滄江河谷海拔2500 m 左右的冰葡萄基地。

1.2 樣品處理

將一定質(zhì)量的冰葡萄果粒在無菌袋中破碎，加入SO2(30 mg/L)，進(jìn)行自然發(fā)酵。葡萄破碎后立即取樣(A 取樣點(diǎn))，48 h 后第2 次取樣(B 取樣點(diǎn))。待發(fā)酵啟動(dòng)，根據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)橇康淖兓咳?具體取樣點(diǎn)如表1 所示)，再進(jìn)行梯度稀釋。

1.3 菌株的形態(tài)劃分

取梯度稀釋后的樣品200 μL 涂布于YEPD 固體培養(yǎng)基平板(加氯霉素100 mg/L)上，28℃富集培養(yǎng)2 ～3 d，挑取單個(gè)菌落劃線接種到WL 培養(yǎng)基上。根據(jù)該培養(yǎng)基上菌落的顏色形態(tài)分型，然后用顯微鏡觀察同種類型不同菌株間形態(tài)是否存在差異，并計(jì)算每種類型菌的數(shù)量。

表1 冰葡萄自然發(fā)酵過程中還原糖和酒精度變化情況Table 1 The change of sugar and alcohol during spontaneous fermentation associated with ice grape

1.4 菌株ITS，18S rDNA 與26SrDNA 的D1/D2 區(qū)序列測(cè)定

根據(jù)WL 培養(yǎng)基聚類分析結(jié)果，隨機(jī)挑選每種類型的菌株2 株，用試劑盒法(生工生物)提取酵母組DNA。使用引物ITS4 和ITS5 對(duì)其ITS 基因進(jìn)行擴(kuò)增［19］。對(duì)個(gè)別ITS 區(qū)域差異性較小的菌株進(jìn)行18S rDNA［20］與26S rDNA 的D1/D2 區(qū)域擴(kuò)增［21］。擴(kuò)增結(jié)束后，以1% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行水平電泳，電壓150V，完畢后紫外燈下拍照擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

測(cè)試結(jié)果通過DNAstar 和Chromas 軟件校對(duì)，然后使用NCBI 搜索，找出與之相似度最高的序列，相關(guān)序列用MEGA 4 軟件經(jīng)CLUSTALW 比對(duì)，采用Jukes-Cantor 模型構(gòu)建N-J 樹。

2 結(jié)果與分析

冰葡萄人為破碎后，在室溫下進(jìn)行自然發(fā)酵(室溫大約為16℃)，在發(fā)酵過程中選取了10 個(gè)樣點(diǎn)，共分離到511 株酵母菌株。

2.1 冰葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

WL 瓊脂培養(yǎng)基可以用來監(jiān)測(cè)飲料發(fā)酵過程中的微生物類群。Cavazza 等［22］研究表明，在葡萄酒自然發(fā)酵過程中出現(xiàn)的大多數(shù)典型的酵母菌種都可以用WL 培養(yǎng)基進(jìn)行區(qū)分。根據(jù)在WL 培養(yǎng)基上酵母的菌落形態(tài)，本實(shí)驗(yàn)篩選的511 株酵母菌株可分為7類(表2)。通過顯微鏡觀察可知，同種類型不同菌株間形態(tài)并不存在差異。通過查詢相關(guān)文獻(xiàn)可知，1，6，7 類酵母分別為Cryptococcus flavescens，Hanseniasporauvarum，Saccharomyces cerevisiae。2，3，4，5 類酵母的菌落形態(tài)未見報(bào)道。

表2 酵母菌落形態(tài)劃分結(jié)果Table 2 Division results of colony morphologies of yeasts

2.2 冰葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌株的分子學(xué)鑒定

根據(jù)WL 分型結(jié)果，從每一類型中選取2 株菌株進(jìn)行DNA 提取，并對(duì)其ITS 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具體擴(kuò)增結(jié)果見圖1，然后進(jìn)行分子鑒定。

從圖1 中可以看出A2 -1，A2 -2，A3 -1，A3 -2，A4 -1，A4 -2，A7 -1，A7 -2 的PCR 產(chǎn)物長度大約為550bp，A5 - 1，A5 - 2 的PCR 產(chǎn)物長度接近500bp，D1 -1，D1 -2，D 2 -1，D2 -2 的PCR 產(chǎn)物長度大約為750bp。

圖1 酵母菌ITS 區(qū)基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 Nucleotide fragments length of the 5．8S-ITS profile in the study

通過對(duì)酵母菌株P(guān)CR 產(chǎn)物測(cè)序，DNAstar 和Chromas 軟件校對(duì)，NCBI 搜索，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2 所示。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹及其同源性高低可知A2-1，A2 -2，A4 -1，A4 -2，A7 -1，A7 -2;A5 -1，A5-2;D1 -1，D1 -2;D2 -1，D2 -2 分別為Cryptococcus flavescens，Hyphopichiapseudoburtonii，Hanseniasporauvarum，Saccharomyces cerevisiae。但A3 -1 與A3 -2 在ITS 區(qū)域與Cryptococcus amylolentus和Tsuchiyaeawingfieldii的堿基序列完全相同，所以對(duì)這2 株菌進(jìn)行多基因序列分析，即對(duì)A3 - 1 與A3 - 2 的18S(SSU)，26S(D1/D2)區(qū)域同時(shí)進(jìn)行分析，最終得出A3 -1 與A3 -2 為Cryptococcus amylolentus。

圖2 5．8SrDNA-ITS 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．2 Phylogenetic tree of 5．8S-ITS gene

2.3 冰葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌株的動(dòng)態(tài)變化

對(duì)冰葡萄自然發(fā)酵過程中的不同階段進(jìn)行取樣，各個(gè)菌種的消長關(guān)系如圖3 所示。

圖3 冰葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌株的動(dòng)態(tài)變化Fig．3 Thedynamic change of the yeasts during spontaneous fermentation associated with ice grape

在A 取樣點(diǎn)，即冰葡萄剛破碎階段，Cryptococcus flavescens占總酵母數(shù)的50%，Cryptococcus amylolentus和Hyphopichiapseudoburtonii各占16．7% 和33．3%。48 h 后，Cryptococcus flavescens，Cryptococcus amylolentus迅速減少甚至消失，Hyphopichiapseudoburtonii成為優(yōu)勢(shì)菌種，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Hanseniasporauvarum。當(dāng)還原糖降為336 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)為1．9%時(shí)，發(fā)酵液中只存在Hanseniasporauvarum與Saccharomyces cerevisiae這2 種酵母。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乙醇含量升高，Hanseniasporauvarum所占的比例呈動(dòng)態(tài)減少趨勢(shì)。當(dāng)還原糖含量為172 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)上升為11．6%時(shí)，發(fā)酵液中只分離到Saccharomyces cerevisiae，直至發(fā)酵結(jié)束。

3 討論

對(duì)于葡萄酒酵母的研究，大量文獻(xiàn)探討的都是正常條件下與成熟漿果有關(guān)的酵母菌群［23］，未見關(guān)于冰葡萄相關(guān)酵母的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)冰葡萄自然發(fā)酵過程中酵母的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了2 種未在相關(guān)報(bào)道中出現(xiàn)的酵母——Cryptococcus amylolentus，Hyphopichiapseudoburtonii。其中，Cryptococcus amylolentus最初是由Walt等人從南非的甲蟲上分離到［24］，之后未見其他分離源。關(guān)于這2 種菌的生理特性有待進(jìn)一步探索。研究表明，在葡萄表皮以及發(fā)酵初期存在大量的非釀酒酵母，非釀酒酵母可以產(chǎn)生水解酶，例如D-葡萄糖苷酶，這有利于香氣成分的產(chǎn)生和增強(qiáng)葡萄酒的綜合特性［25-26］。因此，非釀酒酵母的差異可能是冰葡萄酒有著更為復(fù)雜的香氣結(jié)構(gòu)和獨(dú)特口感的原因之一。此外，在整個(gè)發(fā)酵過程中，Hanseniasporauvarum是非釀酒酵母中在發(fā)酵液里存活時(shí)間最長的菌種。這可能與Hanseniasporauvarum對(duì)酒精有較強(qiáng)的耐性有關(guān)。一些學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)Hanseniasporauvarum可以通過本身的幾種酶來分泌酯和甘油，進(jìn)而對(duì)葡萄酒的香氣產(chǎn)生積極的影響［27］。

盡管釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中起著重要的作用，但在冰葡萄發(fā)酵初期并沒有分離到該菌種，然而從發(fā)酵中期到結(jié)束，釀酒酵母均為優(yōu)勢(shì)菌種，這與之前的研究是相符合的［28］。

在成熟葡萄漿果果皮上，附著著天然的酵母菌，其種類、構(gòu)成比例及菌密度受產(chǎn)地、土壤、氣候、年份、葡萄品種、成熟期、葡萄園的管理狀況等影響。到目前為止，從葡萄表面已經(jīng)分離到52 種酵母，它們屬于22 個(gè)屬:Aureobasidium，Auriculibuller，Brettanomyces，

Bulleromyces，Candida，Cryptococcus，Debaryomyces，Hanseniaspora，Issatchenka，Kluyveromyces，Lipomyces，Metschnikowia，Pichia，Rhodosporidium，Rhodotorula，Saccharomyces，Sporidiobolus，Sporobolomyces，Torulaspora，Yarrowia，Zygoascus，和Zygosaccharomyces［29］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們從冰葡萄發(fā)酵過程中只分離到4 種非釀酒酵母:Cryptococcus flavescens，Cryptococcus amylolentus，Hyphopichiapseudoburtonii，Hanseniasporauvarum，這可能是與該產(chǎn)區(qū)自然條件以及產(chǎn)區(qū)歷史有關(guān)［30］。

了解葡萄漿果發(fā)酵過程中各酵母的動(dòng)態(tài)變化對(duì)葡萄酒的釀造具有重要的意義。本文首次對(duì)赤霞珠冰葡萄相關(guān)酵母資源以及發(fā)酵過程中不同菌種的消長關(guān)系進(jìn)行了研究，這對(duì)德欽產(chǎn)區(qū)冰酒發(fā)酵工藝的控制以及優(yōu)良酵母的篩選和優(yōu)化具有一定的意義，也為該地區(qū)酵母資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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