張鑫，王澤建

(華東理工大學，上海，200237)

生物醫(yī)藥、食品等工業(yè)發(fā)酵中，溶氧一直被視為重要的操作參數。發(fā)酵液中溶氧水平能反映出該發(fā)酵體系中供氧與耗氧之間的關系。目前廣泛使用極譜氧電極是基于電化學原理的電極，電極膜和電極電解液均為高耗耗材，而且成本很高。此外，電極經過高溫滅菌和長期發(fā)酵使用后，漂移大。梅特勒托利多公司新開發(fā)的光學溶氧電極則克服了這些缺點。

氧是難溶于水的氣體，在室溫及常壓條件下，空氣中氧的溶解度僅為7.5 ～8 mg/L。當水中溶有糖或其他鹽類時，氧的溶解度則更低。發(fā)酵過程中，氧參與菌體的生長、產物的形成和維持細胞的代謝，供氧水平的高低嚴重影響著產物的合成。因此，氧傳遞速率的控制對好氧微生物發(fā)酵過程非常關鍵。尤其在大規(guī)模反應器發(fā)酵放大過程中，供氧能力的差異是導致發(fā)酵結果不能重復的一個重要原因。

在耗氧發(fā)酵中，溶氧起著至關重要的作用。各種耗氧微生物發(fā)酵過程中，溶氧水平影響微生物生理代謝從而影響細胞的生長、產物的合成［1］。研究證實，低溶氧會對微生物NAD(P)H、FADH 氧化產生ATP過程產生抑制［2］。據文獻報道，供氧在很多產品，例如有機酸［3］、氨基酸［4］、多糖［5］等的發(fā)酵過程中微生物的代謝調控中作為一個非常關鍵的因素。然而，過高的氧供給會直接將底物氧化而沒有產物表達，提高了發(fā)酵成本。

在工業(yè)過程放大中，氧傳遞速率是一個非常值得注意的參數［6］。隨著溶氧傳感器技術的發(fā)展，基于氧傳遞和溶氧水平的放大方法被建立，并且在發(fā)酵工業(yè)中越來越廣泛的被應用［1］。影響溶氧的因素有氧傳質系數(kLa)和氧消耗速率(OUR)。在一些高耗氧或高密度發(fā)酵過程中，溶氧水平經常會處于臨界氧濃度以下，此時溶氧就很難反應出設備的供氧能力［7］。

1 材料與方法

發(fā)酵罐，上海國強生化裝備有限公司的30L 和50L 自動發(fā)酵罐;電極，梅特勒－托利多pH 和光學溶氧電極InPro6860i;尾氣測量采用Extral Max300-LG過程質譜儀;數據采集分析采用華東理工大學開發(fā)的Biostar5.1。

在線檢測參數由傳感器獲取后發(fā)送到發(fā)酵罐工控機上，再由上位機Biostar 采集，在線計算參數由Biostar 根據在線測量參數自動計算［8］。

2 光學溶氧電極的原理和特點

光學溶氧電極是基于熒光消減原理:通過熒光信號與一個參比信號對比，根據這兩個信號的時間差來計算出氧濃度。此外，梅特勒－托利多的光學溶氧電極采用了ISM(智能電極管理系統(tǒng))模塊。通過這個模塊，溶氧電極可以將獲取到的溶氧值直接以數字信號的形式傳遞給配備的M400 變送器。與傳統(tǒng)的極譜氧電極相比，梅特勒－托利多的光學溶氧電極主要有以下優(yōu)點:

(1)漂移小、響應快。傳統(tǒng)極譜氧電極每一次使用都要進行標定，光學溶氧電極可以連續(xù)使用多批而不需標定，而且響應速度也是明顯優(yōu)于傳統(tǒng)電極，尤其是對低溶氧條件下。光學溶氧電極連續(xù)使用近半年后，對空氣中氧氣顯示仍在100% ±10%，90%相應時間在30s 內。由于其原理和數字信號傳輸，光學溶氧電極的噪音波動非常小，信號比較平穩(wěn)，測量精度1%或8 ppb，顯示精度4 位有效數字，對低溶氧有更靈敏、更精確的響應。

(2)便于管理。具有ISM 的電極，每一支電極都具有獨一無二的電子編號，并且在電極上而不是變送器上保存著標定信息、滅菌次數、剩余壽命數據等信息。使用任何一個兼容的變送器都可以將所有的信息讀出，標定過的電極可以插在任何一個變送器上立即開始使用。

(3)壽命長，耗材少。對于傳統(tǒng)的極譜氧電極，膜和電解液都是高耗值耗材。在5L 罐上，曾出現過新電極使用兩個月后膜就出現可見磨損。相對比的是光學溶氧電極沒有電解液，不需要定期維護。此外，根據ISM 可以計算出剩余壽命供參考。

(4)受溫度影響小。圖1 中展示了在常壓下極譜氧電極電流信號強度和溫度之間關系，通過研究我們發(fā)現:在沒有溫度補償的情況下，溶氧值顯示受溫度影響是很大的。其原因是電極膜對氧的通透性與溫度有關，且溫度會影響電化學反應的速率。光學溶氧電極InPro6860i 本身是光學技術工作原理，且內置溫度探頭做了改進，M400 變送器獲取探頭溫度數據直接進行自動補償，因此受溫度影響更小，精度更高。

圖1 極譜氧電極受溫度影響Fig．1 Influenc of temperature on polarographic oxygen sensor

(5)數字信號傳輸。具有ISM 的電極都是采用數字信號傳輸:電極獲取到信號后，直接由自身芯片(ISM)轉化為數字信號，通過電纜線傳給變送器，抗干擾能力大大高于nA 信號。M400 變送器可以直接以數字形式向工控機輸出，除此之外也提供了4 ～20mA 模擬輸出，對于舊設備的改造也是有很好的兼容性。

3 光學溶氧電極在工業(yè)發(fā)酵過程優(yōu)化中的應用

3.1 工作原理

工業(yè)發(fā)酵中，氧氣可以看作是微生物代謝的一種底物，同樣可以作為限制性底物，同時溶氧一直被作為一個非常重要的操作變量。溶氧水平反應了發(fā)酵過程中供養(yǎng)與耗氧之間的關系，可用以下公式表示:

其中，c為溶氧濃度，OTR為供氧速率，OUR為耗氧速率。根據溶氧的變化，可以在一定程度上推測出微生物的耗氧狀態(tài)。結合尾氣質譜分析，我們可以進一步計算出氧消耗速率(OUR)、二氧化碳生成速率(CER)、呼吸商(RQ)以及氧傳質系數(KLa)。KLa 可用以下公式計算［8］:

其中，OUR為氧氣消耗速率，c*是氧氣飽和濃度，c為發(fā)酵液實測濃度。KLa的在線計算可以實時反應出發(fā)酵液狀態(tài)，設備的狀態(tài)等等。

不同微生物，不同的發(fā)酵過程都具有不同的限制性氧濃度(圖2)。發(fā)酵液中氧濃度低于這個值，微生物就進入氧限制狀態(tài)，即供氧速率(OTR)達不到正常代謝所需的耗氧速率(OUR)，一般會伴隨代謝通路遷移，結果就是產量降低，副產物增多。

圖2 臨界氧濃度和OUR 的關系Fig．2 The relationship between critical oxygen concentration and OUR

3.2 溶氧電極在發(fā)酵應用實例

3.2.1 發(fā)酵液溶氧—轉速聯(lián)動控制

畢赤酵母是一種高耗氧微生物，OUR 水平可達150 ～200mmol/(L·h)，發(fā)酵前期需要控制一個合適的溶氧水平，保證菌濃的快速增長。與復旦大學合作的畢赤酵母表達的項目中，采用了上海國強生化公司的30L 自動發(fā)酵罐。在發(fā)酵初期，采用了溶氧水平反饋調節(jié)攪拌轉速的策略，通過計算機的自動控制使溶氧水平一直保持在25%以上，滿足了微生物迅速繁殖的要求，菌濃在較短時間內達到誘導水平(圖3)。

3.2.2 溶氧－補料控制

圖3 溶氧－攪拌聯(lián)動控制Fig．3 DO-agitation linkage control

發(fā)酵過程中，溶氧的突然回升一般是由于菌體裂解或者底物不足引起的。對于底物不足引起的溶氧回升，補加底物溶氧會迅速下降。因此，可以通過溶氧來反饋控制底物補加，使補加速率在一個合適的水平上。圖4 為另一畢赤酵母發(fā)酵曲線，采用分批補料策略，每當溶氧迅速回升，就意味著發(fā)酵液中碳源不足，此時補入一定量碳源，溶氧快速下降。誘導階段，停止甘油的補加，溶氧回升后經過1 h 左右以后補入一定量的甲醇，溶氧開始緩慢下降，表明微生物已經開始利用甲醇。待溶氧再次快速回升，表明甲醇消耗殆盡，而后開始根據溶氧控制甲醇的流加速率在一個合適的范圍。

3.2.3 溶氧控制發(fā)酵過程節(jié)能減排

圖5 是另一個產品的發(fā)酵曲線。原工藝由于沒有溶氧電極的監(jiān)測，攪拌電機一直高速開到最終放罐。后來經過實驗發(fā)現，后期由于發(fā)酵液黏度下降，使得KLa 上升，供氧能力提高，最終導致溶氧上升。降低攪拌轉速，OUR、CER、RQ均沒有明顯變化，目標產物濃度上升和原工藝對照無明顯差別。因此，新工藝中到發(fā)酵后期采取降轉速策略，節(jié)省了電能。

4 結論

圖5 根據溶氧控制攪拌Fig．5 Control of agitation based on DO

溶氧早已成為現代工業(yè)發(fā)酵中不可缺少的操作參數之一，新型溶氧電極的出現不僅彌補了老式電極的缺陷，還帶有功能強大的智能功能，為工藝開發(fā)放大到生產提供了便利，同時也為工廠生產過程中分析儀表的維護和管理提供了可靠的保障。在發(fā)酵過程監(jiān)測、優(yōu)化放大中，參數相關分析更加離不開溶氧的數據?？刂坪线m的溶氧，既能保證菌體的正常生長，又能盡可能降低攪拌和通氣的成本。

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