李宇輝，王俊鋼，劉成江，郭安民，李開雄

1(新疆農(nóng)墾科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子，832000)2(石河子大學食品學院，新疆 石河子，832000)

奶疙瘩是新疆哈薩克族和蒙古族牧民經(jīng)過酸凝手工自制的奶酪，營養(yǎng)豐富，且經(jīng)過成熟發(fā)酵后生成的肽、胨、氨基酸等極易被人體消化吸收，其中部分脂肪被降解為不飽和脂肪酸，有助于降低人體的血清膽固醇，有利于預防心血管疾?。?］。

近年來工業(yè)化發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)、消費逐漸向牧區(qū)滲透，牧區(qū)部分牧民已開始放棄傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)工藝和方法。長此以往，將逐漸取代新疆特殊氣候環(huán)境、特殊工藝條件下形成的豐富多樣的發(fā)酵乳制品微生物資源，使發(fā)酵乳制品的產(chǎn)品和菌種單一化。奶疙瘩中的主要發(fā)酵菌是產(chǎn)酸凝乳的乳酸菌［2］，在成熟過程中酵母菌可以促進微生物之間的共生作用、CO2的形成、提高特殊風味和香氣方面起著重要的作用［3］。因此對經(jīng)過幾千年馴化的具有優(yōu)良性狀的酵母菌需加強有效保護，防止微生物種質(zhì)資源的流失。

本研究主要對伊犁牧區(qū)的奶疙瘩中的酵母菌進行分離，并對其分布和種類的多樣性進行分析，旨在為發(fā)掘和保護新疆特有的酵母菌種質(zhì)資源和乳制品中優(yōu)良酵母菌的再利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 原料

新疆民族傳統(tǒng)奶酪:采自那拉提牧區(qū)、唐布拉牧區(qū)，托里縣，布爾津等地。

1.2 儀器設(shè)備

全溫振蕩器HZQ-Q 型，哈爾濱東聯(lián)電子科技有限責任公司;數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱 HPX-9272MBE，上海躍進醫(yī)療器械廠;PCR 擴增儀050-810 Tgradient 48，Biometra Tgradient;凈化工作臺SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

菌種分離、使用PDA (Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基，對于樣品中酵母菌的振蕩培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、分離效果較好。

純化保存使用平板和斜面培養(yǎng)基為YPD(Yeast extract Peptone Dextrose)培養(yǎng)基。

生理生化試驗使用氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Gorodkowa 培養(yǎng)基和脲酶培養(yǎng)基［4］。

2 試驗方法

2.1 酵母菌種分離、純化、保存

(1)取1 g 樣品，室溫下溶于10 mL 無菌水中，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)40 min。

(2)將樣品溶液以3%的體積比接種于PDA 液體培養(yǎng)基中，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

(3)將初次接種的PDA 液體培養(yǎng)物采取稀釋平板法涂于YPD 培養(yǎng)基進行分離。

(4)將接種后的YPD 培養(yǎng)基于25 ℃下培養(yǎng)，待長出菌落后，選擇具有酵母菌典型菌落特征的單一菌落進行劃線分離，經(jīng)劃線分離2 ～3 次后，用顯微鏡鏡檢為純種后，分別置于YPD 斜面培養(yǎng)基上保存待用。

2.3 酵母菌的理化性質(zhì)測定

糖發(fā)酵實驗、同化實驗、維生素生長需要實驗、抗性實驗、溫度生長實驗、尿素水解實驗、耐滲透壓實驗等。

2.4 26S rDNA 酵母菌的鑒定

DNA 的提取方法參照文獻引物序列:正向引物NL-1:5'- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3';反向引物NL-4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'［5］。

PCR 擴增:用引物NL1 和NL4 PCR 擴增供試菌體26S rDNA 近5’端的D1/D2 區(qū)域，按下述反應條件進行36 個循環(huán):94 ℃，1 min;53 ℃，1 min;72℃，1 min 20 s。所得產(chǎn)物純化后由北京奧科測序。

3 結(jié)果與分析

經(jīng)過菌種的分離、純化，共得到33 株酵母菌:從伊犁尼勒克縣唐布拉牧區(qū)采集的5 份發(fā)酵乳制品中得到11 株Ym1 －Ym11;從伊犁新源縣那拉提牧區(qū)的5 份樣品中得到9 株Yn1 －Yn9;從托里縣采集的5份樣品中得到酵母菌6 株Yt1 －Yt6;從布爾津縣采集的5 份樣品中得到酵母菌7 株Yb1 －Yb7。

3.1 理化鑒定結(jié)果

由表1 可以得出，33 株酵母菌通過生理生化試驗，根據(jù)酵母菌的特征與鑒定手冊，將33 株酵母菌經(jīng)過檢索歸為5 個種，分別是發(fā)酵型畢赤氏酵母(Pichia fermentans)12 株，膜醭畢赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)1 株，馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)8 株，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)9 株，假絲酵母(Candida zeylanoides)3 株。

表1 新疆伊犁牧區(qū)采集乳制品中分離酵母菌的生理特性Table 1 Physiological characteristics of the yeasts isolated from Cheese collected in Xinjiang Yili

注:1. Pichia fermentans;2. Pichia membranifaciens;3. Kluyveromyces marxianus;4. Saccharomyces cerevisiae;5. Candida zeylanoides。

3.2 酵母菌26S rDNA 鑒定

26S rDNA D1/D2 區(qū)序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行同源序列檢索，比較新鑒定菌株與已知酵母菌相應序列的同源性，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，從庫中獲得與新鑒定菌種相關(guān)屬、種的26S rDNA D1/D2 區(qū)序列。為充分顯示新鑒定菌株與已知酵母菌的親緣關(guān)系及其分類地位，將所有序列用ClustalX 1.81 軟件進行匹配排列Neighbor-Joining 分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

包括11 株實驗菌及相關(guān)菌種模式株在內(nèi)的26S rDNAD1/D2 區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)。從圖1 可以看出，Ym6、Ym9 、Ym11 同屬于K.marxianus同源性達到100%，Ym2、Ym10 經(jīng)鑒定屬于S.cerevisiae，Ym1、Ym3、Ym4、Ym5 、Ym7 屬于P.fermentans同源性在99%以上。唐布拉牧區(qū)奶酪中的優(yōu)勢酵母菌為P.fermentans占總分離菌株數(shù)的45.5%。

從圖2 的發(fā)育樹中不難看出Yn1、Yn9 屬于P.membranifaciens，但Yn1 的生理生化鑒定結(jié)果為P.fermentans。Yn2、Yn3、Yn6、Yn8 同屬于P.fermentans，Yn4 屬于S.cerevisiae同源性達到100%，Yn5、Yn7 同屬于Kluyveromyces屬的Kluyveromyces marxianus同源性達到100%。那拉提牧區(qū)奶酪中的優(yōu)勢酵母菌為P.fermentans占總分離菌株數(shù)的45.5%。

圖1 唐布拉牧區(qū)酵母菌株的發(fā)育樹Figure1 Phyogenetic tree of yeast strains in Tangbula pastoral area

布爾津縣牧區(qū)的樣品中分離得到的Yb2、Yb4、Yb6 同屬于S.cerevisiae(如圖3)其同源性達到100%，Yb5、Yb7 同屬于Kluyveromyces marxianus并達到100%的同源性，Yb3 屬于Candida zeylanoides，此種酵母在發(fā)酵乳制品中并不多見，Yb1 與P.fermentansMg-1 和Pichia kluyveriS148 的相似度都很高，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果將其歸為P.fermentans。布爾津縣牧區(qū)奶酪中的優(yōu)勢酵母菌為S.Cerevisiae，占總分離菌株數(shù)的42.9%。

由圖4 可以得出Yt1、Yt4、Yt6 同屬于S.cerevisiae，Yt5 屬于K.marxianus，Yt2 屬于C.zeylanoides同源性達到100%，Yt3 屬于P.fermentans同源性達到98%以上。托里縣牧區(qū)奶酪中的優(yōu)勢酵母菌為S.cerevisiae占總分離菌株數(shù)的50%。

3.3 伊犁牧區(qū)發(fā)酵乳制品中酵母菌的分布特點

從伊犁牧區(qū)分離到酵母菌的數(shù)量見表2。由表2可知，33 株分離菌株被定為4 屬5 種，唐布拉牧區(qū)的發(fā)酵奶制品中P.fermentans為優(yōu)勢菌(45.5%)，那拉提牧區(qū)的發(fā)酵奶制品中優(yōu)勢菌也是P.fermentans(45.5%)，而托里縣牧區(qū)和布爾津縣牧區(qū)發(fā)酵奶制品中優(yōu)勢菌為S.cerevisiae。4 處不同采樣點都分離出K.marxianus和S.cerevisiae。對于P.fermentans的分布唐布拉和那拉提牧區(qū)較多，而托里縣和布爾津縣較少。

圖2 那拉提牧區(qū)酵母菌株的發(fā)育樹Fig.2 Phyogenetic tree of yeast strains in Nalati pastoral area

圖3 布爾津地區(qū)酵母菌株的發(fā)育樹Fig．3 Phyogenetic tree of yeast strains in Buerjin country

圖4 托里地區(qū)酵母菌株的發(fā)育樹Fig．4 Phyogenetic tree of yeast strains in Tuoli country

表2 伊犁4 個采樣點酵母菌分離株數(shù)量Table 2 Numbers of strains belonging to different species isolated from four places in Yili

4 討論

對于Yn1 的生理生化鑒定結(jié)果為P.fermentans，26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析結(jié)果中Yn1 與Pichia membranifaciensIFO10731 的相似度更大，綜合分析后將Yn1 歸為P.membranifaciens，其余的生理生化鑒定結(jié)果與26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析結(jié)果一致。從試驗中可以得出26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析結(jié)果準確度高，分析簡便，但其對于基因數(shù)據(jù)庫的依賴性較強，有時需要其他方法作為補充和校對。因此對于酵母菌的鑒定來說，傳統(tǒng)生理生化方法與分子生物學技術(shù)相結(jié)合，鑒定結(jié)果更為準確［6］。

很多酵母菌作為乳制品中自發(fā)產(chǎn)生的微生物群落存在，例如釀酒酵母就總是與其他酵母一起，自發(fā)產(chǎn)生于藍紋干酪和軟干酪中［7－8］。此外當釀酒酵母作為發(fā)酵劑使用時可在干酪中進一步形成柔軟的質(zhì)地和高濃度的芳香物質(zhì)［9］。研究表明，酵母菌參與乳制品中碳水化合物的發(fā)酵，并能生產(chǎn)芳香族化合物，同時還可能會刺激乳酸菌的生長，抑制產(chǎn)毒素霉菌的生長，改善乳制品的營養(yǎng)價值，有些菌株還可能有益生菌特性［10］。

本試驗中在4 個地區(qū)的采樣點分離得到的酵母菌的種類和數(shù)量有一定差異，具有明顯的地域性。傳統(tǒng)發(fā)酵的乳制品的微生物的數(shù)量和種類受制作方法、溫度、氣候條件、酸凝乳劑的添加量、當時發(fā)酵成熟的環(huán)境等因素的影響［11］。唐布拉牧區(qū)和那拉提牧區(qū)所處直線距離52 km，海拔相近均在1 100 m 左右，兩個牧區(qū)都有河流流經(jīng)，水源豐富(唐布拉牧區(qū)位于喀什河上游，那拉提牧區(qū)位于伊犁河谷東端)，屬于溫帶大陸性半干旱氣候，相對濕潤。托里縣位于準噶爾盆地西北緣斷山區(qū)，平均海拔1 450 m 左右，氣候相對于那拉提和唐布拉牧區(qū)干燥、多風，與那拉提牧區(qū)直線相距298 km;布爾津縣位于阿爾泰山南麓、額爾齊斯河畔、平均海拔1 390 m 左右，與那拉提牧區(qū)直線相距538 km，屬于溫帶大陸性寒涼氣候，全年多季風。4 個地區(qū)屬于兩種不同的生態(tài)區(qū)域，都具有生物的廣泛性和多樣性，但種類上有所差異。當然對于本試驗中唐布拉、那拉提牧區(qū)與托里縣、布爾津縣樣品中優(yōu)勢菌種的不同，除了考慮氣候、生態(tài)環(huán)境外，還需對制作方法、酸凝乳的添加量、制作季節(jié)、發(fā)酵環(huán)境等因素綜合做進一步的研究。

5 結(jié)論

本研究從新疆伊犁牧區(qū)的4 個地區(qū)共采集到奶酪樣品20 份，從中分離出33 株酵母菌。這些菌株經(jīng)鑒定分別歸為5 個種，其中P.fermentans11 株，P.membranaefaciens2 株，K.marxianus8 株，S.cerevisiae9 株，C.zeylanoides3 株。C.zeylanoides在唐布拉牧區(qū)、托里縣和布爾津縣的樣品中均有出現(xiàn)，初步推斷這兩種氣候差異對于C.zeylanoides的存在影響不大。研究表明，唐布拉牧區(qū)和那拉提牧區(qū)樣品的優(yōu)勢菌株為發(fā)酵畢赤氏酵母(Pichia fermentans)，托里縣和布爾津縣樣品中的優(yōu)勢菌種為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是伊犁牧區(qū)奶酪樣品中的共同菌株。

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