劉紅芳，鄧澤元，徐靚，陳華蓉，劉文群

1(南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

2(江西省環(huán)境信息中心，江西 南昌，330077)

硒(Selenium，Se)是人體必需的重要微量元素之一，低濃度時具有提高免疫、抗氧化、抗病毒、抗癌等生物活性，但在高濃度時反而對人和動物具有毒性，硒在生物活性和毒性之間范圍極端狹窄，因此容易接近或進入了硒的毒性范圍［1］。與無機硒和有機硒相比，納米硒具有較強的高效高安全優(yōu)勢，納米硒(Nano-Se)是采用納米技術(shù)，利用蛋白質(zhì)的酰胺平面對紅色元素硒有吸引作用的原理，控制紅色元素硒形成以蛋白質(zhì)為核、以紅色元素硒為膜和以蛋白質(zhì)為分散劑的納米粒子，將零價硒制成紅色納米顆粒。研究發(fā)現(xiàn)，在體外以蛋白質(zhì)為分散劑合成的紅色納米硒具有低毒高效性［2］。這種利用納米技術(shù)合成紅色納米硒是一種模擬生物紅硒化作用的方法。一些對無機硒耐受性強的微生物，能夠?qū)? 價和4 價硒轉(zhuǎn)化為紅色零價硒。國外在利用微生物進行硒的還原方面研究的較多，已經(jīng)從最初的菌株的篩選發(fā)展到現(xiàn)在對還原機理的探究，而我國在這方面研究較少，目前報道的只有利用假單胞菌(Pseudomonas alcaliphilaMBR)［3－4］、固氮紅細菌(Rhodoacter azotoformans)［5］、棒狀菌屬(Corynebacterium spp)［6］、芽孢桿菌HBS4(BacillusHBS4)［7］來形成納米尺寸的紅色單質(zhì)元素硒;但是國外研究學者還發(fā)現(xiàn)根瘤菌(Rhizobiumsp. Strain B1)［8］、大腸桿菌(Escherichia coli)［9］、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(stenotrophomonas maltophilia)［10］、Tetrathiobacter kashmirensis［11］等微生物能將亞硒酸鹽或者硒酸鹽還原成紅色納米單質(zhì)硒。生物體形成的是納米尺度、膠體狀態(tài)紅色元素硒，這種納米紅色元素硒對熱穩(wěn)定，不轉(zhuǎn)化形成灰或黑色元素硒。

本實驗利用對亞硒酸鈉有較強耐受性的一株編號LA4 乳酸菌株進行亞硒酸鈉還原反應(yīng)，研究分析亞硒酸鈉對乳酸菌LA4 生長的影響，并通過X 射線光電子能譜儀(XPS)測試以及透射電鏡分析(TEM)研究乳酸菌是否將亞硒酸鈉還原為紅色單質(zhì)硒，為今后更經(jīng)濟、更迅速的合成高安全性納米硒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

本實驗室保藏的乳酸菌。

1.1.2 培養(yǎng)基［12］

MRS 液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g(或10 g)，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏(或干粉)5 g，檸檬酸二胺2 g(或檸檬酸鈉5 g)，K2HPO42 g，乙酸鈉5 g，MgSO4·7H2O 0.58 g(或0.2 g)，MnSO4·4H2O 0.25 g(或0.05 g)，吐溫－80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH6.2 ～6.4。

MRS 固體培養(yǎng)基:MRS 液體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂。

1.1.3 主要設(shè)備

H-600 Electron Microscope，HITACHI;ESCALAB250 型X 射線光電子能譜儀，美國Thermo;752N紫外－可見分光光度計，上海精科;SF2000 三按鍵電子數(shù)顯卡尺，Guang Lu;飛鴿KA-1000 型離心機，電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械三廠;電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

參照文獻［13］方法篩選抗高濃度亞硒酸鈉菌株。在裝有100 mL MRS 液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入滅菌的亞硒酸鈉，使終濃度為6 mmol/L(103.92 mg/L)。再接入已活化的乳酸菌，在37℃、150 r/ min振蕩培養(yǎng)48 h，菌體活力能夠通過發(fā)酵培養(yǎng)基所形成的紅色深淺程度來判斷，同時利用分光光度法測其亞硒酸鈉還原率。然后將還原率較高的培養(yǎng)菌懸液在含6 mmol/L(103.92 mg/L)亞硒酸鈉的瓊脂平板上再劃線培養(yǎng)，挑取紅色單菌落繼續(xù)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過發(fā)酵培養(yǎng)基形成的紅色深淺程度和亞硒酸鈉還原量來判斷，再次將培養(yǎng)菌懸液在平板上劃線培養(yǎng)挑取單菌落。這個步驟重復(fù)3 次以保證獲得純化的菌株。

1.2.2 亞硒酸鈉含量的測定

參照文獻［14］分光光度法測定培養(yǎng)液亞硒酸鈉含量。

1.2.3 亞硒酸鈉對乳酸菌LA4 生長的影響

(1)將乳酸菌劃線培養(yǎng)在含不同濃度的亞硒酸鈉瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察不同濃度的亞硒酸鈉對菌落大小的影響。

(2)對生長曲線的影響:分別對含不同濃度的亞硒酸鈉發(fā)酵液每3 h 取1 次樣，測其OD值。采用紫外可見光分光光度計在600 nm 測定菌液的OD值。

1.2.4 紅色納米硒的合成

在裝有100 mL MRS 液體培養(yǎng)基中加入所需濃度經(jīng)紫外滅菌的亞硒酸鈉，之后接入已活化的乳酸菌，在37℃、150 r/ min 振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.5 X 射線光電子能譜( XPS)

利用高速臺式離心機在25℃、10 000 r/min 的情況下對發(fā)酵液進行離心，得到沉淀物，室溫自然風干后，利用XPS 對其進行成分測定。

1.2.6 透射電子顯微鏡分析樣品制備［5］

發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min 離心10 min 收集菌體，所得菌體再用無菌生理鹽水洗滌3 次，用毛細管吸取菌懸液滴在銅網(wǎng)上，室溫干燥后進行透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 高濃度亞硒酸鈉還原菌株的篩選

本實驗篩選得到了5 株還原率較高的菌株，從中挑選了1 株在103.92 mg(6 mmol/L)亞硒酸鈉濃度下，通過分光光度法測其亞硒酸鈉還原量為35.01 mg(2.02 mmol/L)，還原效率為33.69%，同時在69.28 mg(4 mmol/L)亞硒酸鈉濃度下，亞硒酸鈉還原量為32.42 mg (1.87 mmol/L)，還原效率為46.79%的菌株進行接下來的試驗，編號為LA4。

圖1 LA4 菌株在含6mmol/L 亞硒酸鈉瓊脂平板上形成的紅色菌落Fig.1 Red-colored colonies of Lactobacillus LA4 on agar plates that containing 6mmol/L Na2SeO3

2.2 亞硒酸鈉對乳酸菌LA4 生長的影響

將乳酸菌LA4 劃線培養(yǎng)在含不同濃度的亞硒酸鈉瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察不同濃度的亞硒酸鈉對菌落大小的影響。從圖2 可以看出亞硒酸鈉濃度就算達到32 mmol/L 也不能完全抑制乳酸菌LA4 的生長，從而表明乳酸菌LA4 對高濃度亞硒酸鈉具有較強的耐受性。

圖2 亞硒酸鈉對乳酸菌LA4 菌落大小的影響Fig.2 Effect of selenite on the growth (colony size)of Lactobacillus LA4

分別對含不同濃度的亞硒酸鈉發(fā)酵液每3 h 取一次樣，在600 nm 測定菌液的OD值，研究亞硒酸鈉對乳酸菌LA4 生長曲線的影響。從圖3 可以看出，乳酸菌LA4 在未添加亞硒酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基中，9 h 之后就進入對數(shù)生長期，24 h 達到穩(wěn)定期;然而乳酸菌LA4 在與亞硒酸鈉作用過程中，都需要經(jīng)過24 h 的延緩期才進入對數(shù)生長期，39 h 達到穩(wěn)定期，但穩(wěn)定期明顯縮短，提前進入衰亡期。由此可推論得到，隨著硒的添加，細菌的生長得到抑制。從圖3 還可以看出，隨著硒濃度的增大，硒對細菌生長的抑制增強，但細菌對各組溶液的適應(yīng)時間幾乎一致。添加1 mmol/L 亞硒酸鈉的發(fā)酵液最終OD值最大，2 mmol/L 亞硒酸鈉組次之，4 mmol/L 亞硒酸鈉組最終OD值最小。由此可見，發(fā)酵液最終OD值是隨著硒添加濃度的增加而相應(yīng)減小。

2.3 透射電鏡分析(TEM)

透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，生長在不含Na2SeO3培養(yǎng)基的乳酸菌LA4 長約4 μm，直徑0.92 μm，培養(yǎng)基和細菌表面并沒有球狀顆粒(圖4A)。從圖4B 和4C 可以看出，含2 mmol/L Na2SeO3和4 mmol/L Na2SeO3的樣品中都出現(xiàn)納米尺寸的球狀顆粒，顆粒粒徑基本在50 ～200 nm，也有少數(shù)顆粒粒徑比較大，在200 ～350 nm;相比4 mmol/L Na2SeO3，含2 mmol/L Na2SeO3樣品中的球狀顆粒更豐富些。這些球狀顆粒不僅隨機分布在細胞表面，而且還隨機分布在培養(yǎng)基中。圖4D 顯示4 mmol/L Na2SeO3樣品室溫放置4 周后，樣品中的球狀顆粒依然是納米尺寸的，并且肉眼觀察到樣品依然呈紅色，這表明形成的紅色球狀顆粒非常穩(wěn)定，不容易發(fā)生轉(zhuǎn)變。這些球狀顆粒很可能就是乳酸菌LA4 將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化形成的納米單質(zhì)硒顆粒。

圖3 乳酸菌LA4 在含不同濃度亞硒酸鈉培養(yǎng)基中的生長曲線(600 nm 處的OD 值變化)Fig.3 The growth curve of Lactobacillus LA4 in culture medium with different concentrations of sodium selenite(OD at 600 nm)

圖4 生長在MRS 液體培養(yǎng)基中乳酸菌LA4 的整體細胞透射電鏡圖(工作電壓:75 kV)Fig.4 Transmission electron micrographs of whole mounts of cells of Lactobacillus LA4 from a stationary phase culture grown in MRS medium containing

2.4 X 射線光電子能譜儀(XPS)測試結(jié)果

對上述培養(yǎng)基中含4 mmol/L Na2SeO3的樣品(離心所得的沉淀需自然風干)進行了XPS 光譜測試分析，結(jié)果如圖5 參照文獻［15］以及John 等［16］編寫的X 射線光譜分析手冊分析XPS 光譜圖結(jié)果，根據(jù)圖譜中Se 的3d 峰位(3d 峰是Se 的峰值中最高的峰)55.6 ev 斷定樣品中含有零價單質(zhì)硒，另外，還可以推斷樣品中存在其他價態(tài)硒(圖5B)。由此表明乳酸菌LA4 已經(jīng)部分將亞硒酸鈉還原為紅色的單質(zhì)硒沉淀，但并沒有完全還原，與上述2.1 中分光光度法測定此4mM 樣品的亞硒酸鈉還原效率(46.79%)結(jié)果一致。

圖5 沉淀物的XPS 圖譜Fig.5 X-ray photoelectron spectroscopy analysis(XPS)of precipitate

3 討論

實驗表明，乳酸菌LA4 對高濃度的亞硒酸鈉具有一定耐受性，經(jīng)分光光度法測定得知在4 mmol/L亞硒酸鈉濃度下，亞硒酸鈉的還原量為1.87 mmol/L，還原效率為46.79%。并將其亞硒酸鈉還原產(chǎn)物通過X 射線光電子能譜儀(XPS)測試，發(fā)現(xiàn)乳酸菌LA4 能將亞硒酸鈉還原為紅色單質(zhì)硒。觀察透射電鏡(TEM)測試圖，發(fā)現(xiàn)添加亞硒酸鈉的發(fā)酵液中，細胞表面以及培養(yǎng)基中都出現(xiàn)大量納米尺寸的球狀顆粒，粒徑基本在50 －200 nm 之間，從而表明乳酸菌LA4 很有可能將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化成納米尺寸的紅色單質(zhì)硒。大量研究表明，納米硒粒徑在200 nm 以內(nèi)才具有生物學效應(yīng)［17］。與Péter Eszenyi 等［18］利用乳酸菌合成的100 ～500 nm 粒徑的納米硒顆粒相比，本實驗利用乳酸菌LA4 很有可能轉(zhuǎn)化合成了粒徑更小的球狀顆粒。電鏡測試結(jié)果表明此樣品室溫放置4 周后，樣品中的球狀顆粒依然是納米尺寸的，并且肉眼觀察到樣品依然呈紅色。這表明形成的紅色球狀顆粒非常穩(wěn)定，不容易發(fā)生轉(zhuǎn)變。

納米級紅色單質(zhì)硒具有毒性小，生物活性高，能夠充分被人體吸收等優(yōu)點，因此人們已經(jīng)開始著手用納米硒替代毒性較大的亞硒酸鹽［19］。本研究篩選得到耐高濃度亞硒酸鈉的乳酸菌LA4(在含32 mmol/L亞硒酸鈉的瓊脂平板上依然形成直徑約0.5 mm 的菌落)，利用該菌株可以還原環(huán)境中的亞硒酸鹽得到活性單質(zhì)硒。雖然乳酸菌還原亞硒酸鈉形成紅色納米單質(zhì)硒的機制比較復(fù)雜，但操作較為簡便，易于擴大化，因此在工業(yè)上具有良好的應(yīng)用前景。

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