劉鳳茹，曹漪，王莉，王韌，陳正行

(江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

鈣是人體內(nèi)不可或缺的礦物質(zhì)成份，不僅參與骨骼的新陳代謝，而且還是維持人體正常生理活動所必須的，如調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮，維持血液凝固，提供細(xì)胞活動能量等［1］。鈣制劑的發(fā)展分為3 代，包括以無機(jī)鹽為主(碳酸鈣、氯化鈣等)的第1 代、以有機(jī)酸鹽為主(乳酸鈣、葡萄糖酸鈣等)的第2 代和以有機(jī)酸螯合鈣源為主(天門冬酸鈣等)的第3 代鈣產(chǎn)品［2］。近年研究人員提出了一個新的有機(jī)微量元素的可能吸收機(jī)理——小肽吸收理論。金屬離子和小肽螯合后，完整的肽作為礦物質(zhì)的配體通過肽轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入粘膜細(xì)胞，一方面提高了肽的利用率，同時加快了以螯合態(tài)存在的金屬離子在消化道經(jīng)過胃及小腸中離子吸收部位時的吸收速度［3］。小肽理論的提出和發(fā)展，推動了第4 代小肽金屬螯合物的研制進(jìn)程，開發(fā)具有特定活性和運(yùn)載鈣離子能力的小肽絡(luò)合物有著廣闊的發(fā)展空間。

乳及乳制品是富含鈣的食物，被作為公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)鈣來源，如酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides，CPPs)有利于促進(jìn)腸道鈣的吸收，主要依據(jù)是CPP 結(jié)構(gòu)中的磷酸絲氨酸殘基［-Sex(p)-］成簇存在且?guī)ж?fù)電荷，在小腸的離子吸收部位(pH7 ～8 的環(huán)境)，能以配體形式有效地與鈣形成可溶性絡(luò)合物，抑制不溶性沉淀的形成，最終可因游離鈣的濃度提高而促進(jìn)鈣的被動吸收［4］;研究還發(fā)現(xiàn)，一些不含有磷酸絲氨酸殘基的蛋白或肽也具有絡(luò)合鈣離子和促進(jìn)其吸收的作用，如大豆蛋白［5］、乳清蛋白［6］、低值魚蛋白［1］、豬血蛋白［7］等。報道稱這些肽與鈣離子的絡(luò)合能力可能與肽段的分子量、氨基酸組成、氨基酸序列以及羧基含量等有關(guān)［8］。然而有部分人群對牛奶和大豆過敏，目前研究較多的蛋白大部分都是動物蛋白，因此，開發(fā)新的質(zhì)高價廉的植物蛋白資源鈣制劑勢在必行。

小麥胚芽作為小麥籽粒的生命源泉，是整個麥粒營養(yǎng)價值最高的部分。麥胚蛋白含有8 種必須氨基酸，比例合適，數(shù)量充足，有很好的氨基酸平衡，是一種完全蛋白質(zhì)［9］。麥胚蛋白中還蘊(yùn)涵著許多具有生物活性的氨基酸序列，這些肽段上帶負(fù)電荷的氨基酸、含有羥基側(cè)鏈的氨基酸(Thr、Ser)、具有游離羧基的氨基酸以及某些特殊氨基酸(His、Lys、Arg)側(cè)鏈等易與鈣離子結(jié)合形成穩(wěn)定的容易被吸收和利用的金屬離子絡(luò)合物［10］。因此，本研究以小麥胚芽蛋白為原料，采用不同蛋白酶酶解后將其與鈣進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)制備第四代鈣復(fù)合物。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

小麥胚芽由河南漫天雪食品有限公司提供。

主要試劑:堿性蛋白酶(Acalase)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)、中性蛋白酶(Neutrase)和木瓜蛋白酶(Papain)(諾維信酶制劑公司);標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(Bio-rad 公司);Tris(百靈威科技有限公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

SHA-B(A)水浴恒溫振蕩器，金壇市榮華儀器制造有限公司;UV-2800 型紫外可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司;冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司;BECKMAN Coulter Avanti J-26 XP 高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼公司;Mini-PROTEAN 小型垂直電泳儀，美國Bio-rad 公司;Agilent 1100 HPLC，美國安捷倫科技有限公司;Nicolet Nexus 470 FT-IR 傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Electron 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥胚蛋白鈣離子絡(luò)合物的制備

(1)小麥胚芽蛋白的提取:小麥胚芽用正己烷脫脂3 遍，脫脂麥胚與去離子水按質(zhì)量比1∶10 混合攪拌，再加入3%的NaCl 攪拌30 min，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)漿液的pH 到9.5，攪拌1h 后在2 420 g 下離心20 min，然后用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)上清液的pH 到4.0，9 680 g 下離心20 min，沉淀物水洗3 次后調(diào)節(jié)pH 到7.0 即為麥胚分離蛋白(WGPI)，冷凍干燥后4℃保存。

(2)小麥胚芽蛋白的酶水解:稱取一定量的麥胚蛋白與去離子水配成5%的溶液，酶與底物比率為2%，分別在每種酶的最佳水解條件下進(jìn)行酶解(Acalase:50℃，pH 8.0;Protamex:50℃，pH 6.5;Flavourzyme:50℃，pH 7.0;Neutrase:50℃，pH 7.0;Papain:55℃，pH 7.0)，并記錄5h 內(nèi)酶解進(jìn)程中的水解度變化。

(3)小麥胚芽蛋白酶解物的鈣離子絡(luò)合:稱取0.1g 麥胚蛋白，加5 mL 20 mmol/L 的Tris-HCl(pH 7.8)溶液，再加0.5mL 0.2 mol/L 的CaCl2溶液，用漩渦振蕩器混合均勻，在恒溫振蕩水浴鍋中40℃下反應(yīng)1 h，8 000 r/min 離心10 min，上清液中加入30 mL 無水乙醇靜置沉淀，8 000 r/min 離心10 min，沉淀50℃下烘干并稱重，最后用0.01 mol/L 的EDTA滴定。以上每個實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次。

1.2.2 pH-Stat 測定水解度

其中，B:消耗堿量;Nb:堿的摩爾濃度;α:麥胚分離蛋白氨基的平均解離度，與溫度和pH 值有關(guān);Mp:被水解蛋白的質(zhì)量(g);htot:每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)(麥胚蛋白htot=8.3)。

1.2.3 麥胚蛋白鈣離子絡(luò)合物鈣含量的測定

網(wǎng)頁設(shè)計與制作作為中職計算機(jī)專業(yè)的主要課程，是社會發(fā)展中最熱門的一門專業(yè)，目的就是讓學(xué)生掌握關(guān)于網(wǎng)頁設(shè)計的技能，為今后的網(wǎng)頁設(shè)計奠定基礎(chǔ)。如表1所示。

按照“GB/T 5009．92 －2003，食品中鈣的測定”中EDTA 滴定法測定絡(luò)合物中鈣含量，以每克蛋白中鈣的毫克數(shù)(mg/g)來表示。

1.2.4 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDSPAGE)

SDS-PAGE 是根據(jù)Laemmli［11］的方法在12%分離膠和5%濃縮膠的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行。蛋白質(zhì)樣品溶解再0.125 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 為6.8)中，含1% (w/v)SDS，2%的(v/v)2-巰基乙醇(2-ME)，5% (v/v)甘油和0.025% (w/v)溴酚藍(lán)，電泳前在沸水中加熱5min;每個泳道上樣量為10 μL，電泳在恒定電流20mA 下運(yùn)行約3 h;分離膠用0.25%的考馬斯亮藍(lán)R-250(溶于50%的甲醇水溶液中)進(jìn)行染色，然后在7.5%乙酸中脫色。

1.2.5 氨基酸組分分析

麥胚蛋白酶解物的氨基酸組分測定根據(jù)Yang［12］等人的方法略作改動，用6 mol/L 的HCl 在110℃下水解22 h 后，在Agilent 1100 氨基酸分析儀上進(jìn)行分析。定量方法:采用外標(biāo)法定量。

1.2.6 麥胚蛋白酶解物的分子量分布

分子量分布是根據(jù)Zhuang［13］等人的方法采用凝膠過濾色譜柱(TSK 凝膠G2000 SWXL 7.8 mm×300 mm)在Agilent 1100 HPLC 系統(tǒng)中進(jìn)行測定。流動相V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=30∶70∶0.1)，流速0.5 mL/min，30℃下220 nm 處監(jiān)測。所使用的標(biāo)準(zhǔn)品是三肽GGG (Mr 189)、四肽GGYR (Mr 451)、桿菌肽(Mr 1450)、抑肽酶(Mr 6500)和細(xì)胞色素C(Mr 12500)。

將樣品配制1 mg/mL 溶液后，以去離子水做參比對儀器進(jìn)行基線掃描，用UV-2800 紫外可見分光光度計掃描測定190 ～800 nm 吸光度值的變化，波長掃描間隔2 nm，以波長與吸光度值繪制該樣品的光譜曲線。

1.2.8 麥胚蛋白鈣絡(luò)合物的紅外分析

將含有約1%樣品的溴化鉀粉末用瑪瑙研缽磨細(xì)后壓片，采用Nicolet Nexus 470 型傅立葉紅外光譜儀分析，掃描波數(shù)范圍為4 000 ～400 cm－1，掃描32次，分辨率為4 cm－1。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 小麥胚芽蛋白的酶解進(jìn)程

圖1 顯示了堿性蛋白酶(Acalase)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)、中性蛋白酶(Neutrase)和木瓜蛋白酶(Papain)以小麥胚芽分離蛋白為底物酶解5h 的水解度變化趨勢。在酶解的最初30 min 之內(nèi)，5 種蛋白酶的酶解速度均較快，水解度顯著升高;1 h 后木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的水解速度明顯減緩，逐漸趨于恒定，最大水解度分別為10.4%、5.7%和4.5%;堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解速度一直呈上升趨勢，水解后期稍有減緩，最大水解度分別為22.4%和21.1%，這個結(jié)果與Zhu［14］的報道一致。由此可見，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶均易水解麥胚蛋白，且前者的水解程度略高，而風(fēng)味酶的水解效果最差。

圖1 小麥胚芽蛋白酶解進(jìn)程曲線Fig. 1 The enzymolysis process curve of wheat germ protein

2.2 麥胚蛋白水解物與鈣離子絡(luò)合反應(yīng)

不同水解時間的麥胚蛋白水解物與鈣離子絡(luò)合的情況如圖2 所示。圖2a 揭示了蛋白水解產(chǎn)物結(jié)合鈣離子的能力，堿性蛋白酶各個酶解時間的產(chǎn)物均具有較高的鈣絡(luò)合能力，除了木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物絡(luò)合鈣能力隨著酶解時間的延長而降低，其余蛋白酶均隨酶解時間延長而增加，絡(luò)合能力由強(qiáng)到弱依次為:堿性蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶;圖2b 表明隨著水解時間延長絡(luò)合物得率略有提高，但不顯著，得率最高的是堿性蛋白酶水解液，其次是復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶。另外，隨著堿性蛋白酶水解液的水解度(水解時間延長)逐漸提高，鈣離子鍵合能力增強(qiáng)，且水解度為21.5%時鈣的結(jié)合量達(dá)到最大值18 mg/g 蛋白，之后鍵合能力略有下降。這主要是因?yàn)榈鞍姿獬潭忍岣?，蛋白質(zhì)酶切片段增多，暴露出更多的活性位點(diǎn)，但水解進(jìn)一步加深后，蛋白酶加劇了活性片段的水解，從而降低了具有鍵合能力的活性位點(diǎn)數(shù)。綜上分析，堿性蛋白酶具有更高的麥胚蛋白水解活性，是制備高鍵合鈣能力水解液的最適合酶類，且水解程度達(dá)到一定范圍時(DH在21.5%附近)具有最高的鈣離子鍵合能力。

圖2 麥胚蛋白鈣絡(luò)合物的鈣絡(luò)合量及得率Fig. 2 The calcium content and yield of wheat germ protein-calcium complex (WGP-Ca)

2.3 進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)的麥胚蛋白水解物電泳分析

圖3 為麥胚蛋白與不同酶水解產(chǎn)物的電泳圖譜，可以看出不同酶對麥胚蛋白的水解情況是顯著不同的。圖3f 將麥胚中的4 種蛋白按Osborne 分類法分別提取出來與WGPI 對比發(fā)現(xiàn)，WGPI 包含了清、球、醇溶和谷蛋白，且主要為清蛋白和球蛋白，相對分子質(zhì)量范圍主要分布在15 ～100 kDa，有4 個明顯的區(qū)域帶:50 kDa、32 ～34 kDa、28 kDa 和14 ～17 kDa，還有3 個高分子量亞基，分別是100 kDa、80 kDa 和70 kDa 以及1 個低分子量亞基20 kDa;麥胚清蛋白亞基豐富，分布均勻，相對分子質(zhì)量范圍主要分布在14 ～100 kDa 之間;球蛋白主要包括4 個明顯的區(qū)域帶:50 kDa、32 kDa、28 kDa 和17 kDa。

圖3a 和圖3e 的譜帶變化最為明顯，在圖3a 中水解0.5h 時，堿性蛋白酶將麥胚蛋白中的高分子量亞基迅速降解，只剩34 kDa 和＜17 kDa 兩個明顯的區(qū)域以及少量的47 kDa、20 kDa 和18 kDa 條帶;隨后堿性蛋白酶將麥胚蛋白亞基逐漸全部水解成分子量在15 kDa 以下的小分子肽;圖3e 中，木瓜蛋白酶在0.5h 內(nèi)就將麥胚蛋白分子量降解到15 kDa 以下，其水解速度之快顯而易見，但這對于獲得高鍵合鈣離子肽并非是有利的，這已從圖2 中獲得證實(shí);圖3c 中風(fēng)味蛋白酶對麥胚蛋白的水解程度不明顯，水解時間的改變也沒有影響蛋白水解，這與圖1 中水解度的研究結(jié)果相一致;圖3d 中中性蛋白酶對麥胚蛋白水解略好于風(fēng)味蛋白酶，但蛋白水解液的主要譜帶區(qū)域沒有發(fā)生顯著變化;圖3b 中復(fù)合蛋白酶主要水解麥胚蛋白的高分子量亞基，100 kDa 和80 kDa 首先被水解，然后依次水解70 kDa 和50 kDa，最后產(chǎn)物中主要含有34 kDa 和＜17 kDa 兩個明顯的區(qū)域譜帶。

圖3 不同反應(yīng)時間麥胚蛋白水解液電泳圖Fig. 3 The electrophoresis pattern of wheat germ protein hydrolysates at different enzymatic time

結(jié)合圖2 的結(jié)果得出，麥胚分離蛋白中100、80、70、50、32 ～34 kDa 亞基的水解與鈣離子鍵合能力密切相關(guān)。復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶對麥胚蛋白中50 及32 ～34 kDa 兩個主要的譜帶區(qū)域水解很少或幾乎不水解，顯著影響了這3 種水解產(chǎn)物的鈣離子鍵合能力;堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶均能成功地水解麥胚分離蛋白中所有亞基，但木瓜蛋白酶水解物親和鈣離子能力遠(yuǎn)小于堿性蛋白酶水解物，這主要是因?yàn)閴A性蛋白酶是由地衣芽孢桿菌發(fā)酵而得，是一種內(nèi)切酶，催化部位為絲氨酸;而木瓜蛋白酶屬于內(nèi)肽酶，具有較寬的底物特異性，作用于蛋白質(zhì)中L-精氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸殘基羧基參與形成的肽鍵，可能破壞了活性肽段的氨基酸序列，從而降低了親和鈣離子能力。

2.4 麥胚蛋白水解物氨基酸組分分析

隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行麥胚蛋白逐漸被水解成小肽和氨基酸，不同酶解產(chǎn)物中的氨基酸組分比例變化如表1 所示。數(shù)據(jù)顯示堿性蛋白酶酶解后主要組分是Glu、Arg、Asp、Val 和Leu;復(fù)合蛋白酶酶解后主要組分是Glu、Arg 和Asp;風(fēng)味蛋白酶酶解后主要組分是Glu、Arg、Asp 和Gly;中性蛋白酶酶解后主要組分是Glu、Arg、Asp 和Gly;木瓜蛋白酶酶解后主要組分是Glu、Arg 和Asp;可見，在各種酶解產(chǎn)物中Glu、Arg、Asp 和Gly 在總氨基酸中都占有較高比例，但堿性蛋白酶酶解物中Thr、Val、Phe、Leu 和Ile 的比例均高于其他酶解產(chǎn)物，這些氨基酸大部分屬于疏水性氨基酸，表1 還顯示了堿性蛋白酶酶解物的總疏水性氨基酸比例在所有酶解產(chǎn)物中最高。因此，可以得出水解物中Glu、Arg、Asp 和Gly 與鍵合鈣離子能力密切相關(guān)，且疏水性氨基酸含量也起到了重要作用。

表1 麥胚蛋白水解物氨基酸組分含量分析(%)Table 1 The analysis of amino acid composition proportion in wheat germ protein hydrolysates

2.5 堿性蛋白酶酶解物分子量分布

在堿性蛋白酶最佳酶解工藝條件下制備麥胚蛋白酶解液，經(jīng)離心和3、5、10 kDa 的超濾膜過濾后，通過高效液相凝膠色譜法對各截留組分進(jìn)行分子量分布的測定，結(jié)果如表2 所示。表2 表明P2 和P3 組分鍵合鈣離子能力顯著高于P1 和P4 組分，這主要是因?yàn)樵赑1 組分中＜500 kDa 的蛋白含量高達(dá)56.65%，其中主要是氨基酸等小分子物質(zhì)，而P4 組分中含有10.51%的蛋白分子量＞5000kDa 的大分子蛋白，由此可見，蛋白分子量太小(＜500 kDa)或是太大(＞5 000 kDa)均不利于鍵合鈣離子;具有高鍵合鈣離子能力的P2 和P3 組分中500 ～2 000 kDa 范圍的蛋白分子比例分別達(dá)到39.22%和37.79，＞5 000 kDa 和＜500 kDa 的部分分別低于2%和50%，即分子量主要分布在2000 kDa 以下的酶解物具有更高的鈣離子鍵合能力，該測定結(jié)果與大部分關(guān)于鈣螯合肽的研究結(jié)果［6，15］相符，為其進(jìn)一步的分離純化打下了很好的基礎(chǔ)。

表2 堿性蛋白酶酶解物經(jīng)分子截留后各部分的分子量分布Table 2 The molecular weight distribution of alkaline protease hydrolysates after ultrafiltration membrane retention

2.6 麥胚蛋白鈣絡(luò)合物全波長掃描

一般來說，蛋白(肽)的吸收主要集中在190 ～325 nm 這個范圍。從圖4 中小麥胚芽蛋白鈣絡(luò)合物的近紫外區(qū)光譜可知，麥胚蛋白肽在約216 nm 處有強(qiáng)吸收峰，這是肽鍵的特征吸收峰，在260 nm 附近處也有一個較強(qiáng)吸收峰，一般為蛋白中Phe 殘基的吸收峰;與麥胚蛋白相比，絡(luò)合物中此兩峰消失，且絡(luò)合物的最大吸收峰高度顯著增高、增寬，位置向長波方向移動了，說明Ca2+與麥胚蛋白中的酰胺鍵發(fā)生了作用，形成了基態(tài)絡(luò)合物。一般絡(luò)合物的生成會使其配位體對光吸收性能發(fā)生改變［16］，這是因?yàn)辂溑叨嚯呐c鈣結(jié)合后相應(yīng)原子的價電子躍遷不同的反映，證明了它們之間發(fā)生了配合反應(yīng)，此結(jié)果與Yu［17］報道的膠原蛋白鈣復(fù)合物的結(jié)果相類似。綜合比較可得出WGP-Ca 是一種不同于麥胚多肽的新物質(zhì)。

2.7 麥胚蛋白鈣絡(luò)合物紅外分析

由氨基酸的紅外光譜可見，在特征區(qū)，—NH2的吸收峰在3 025 cm－1發(fā)生紅移，移動到了3 204 cm－1，說明水解蛋白中的—NH 鍵發(fā)生了明顯的化學(xué)反應(yīng);在指紋區(qū)，C = O 的吸收峰紅移至1 628 cm－1，—COO—的吸收峰在1 450 cm－1消失。比較兩圖可知，氨基酸中的—NH2、—COOH 的吸收峰均發(fā)生了移動，說明它們均參與反應(yīng);而且在2 100 cm－1處的一個較強(qiáng)的吸收峰消失了，這與日本特許公報［18］中介紹的α－氨基酸在2 100 cm－1處有一特征峰，絡(luò)合之后該峰就消失的報道一致，所以可判斷該產(chǎn)品是多肽鈣的絡(luò)合物。

圖4 小麥胚芽蛋白鈣絡(luò)合物的全波長掃描圖譜Fig.4 The fullwavelength scan pattern of wheat germ protein-Calcium complex

圖5 小麥胚芽蛋白鈣絡(luò)合物的紅外光譜Fig.5 The infrared spectroscopy of wheat germ protein-Calcium complex

3 結(jié)論

小麥胚芽蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物能與鈣離子發(fā)生鍵合反應(yīng)形成肽鈣絡(luò)合物，堿性蛋白酶是水解麥胚蛋白的最佳催化劑，首先作用于麥胚蛋白的高分子量亞基上，逐漸水解中低分子量亞基，最終水解成15 kDa 以下的小分子肽;具有高鍵合鈣離子能力的水解產(chǎn)物中含有特定的氨基酸組分和高比例的疏水性氨基酸，且分子量在2 000 Da 以下的小肽易與鈣發(fā)生鍵合反應(yīng);全波長掃描和紅外圖譜表明肽段上的氨基和羧基均參與了鍵合反應(yīng)，并生成了新的物質(zhì)。麥胚肽鈣絡(luò)合物在胃腸道中的穩(wěn)定性及釋放情況還有待后續(xù)研究。

［1］ Jeon S J，W -G Kim，K B Song． Isolation of a Calciumbinding Substance from Anchovy［J］． Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry，2010，53(4):516 －518.

［2］ 曾敏莉，周遠(yuǎn)大. 鈣制劑的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢［J］． 兒科藥學(xué)雜志，2004，10(3):16 －18.

［3］ 蘇純陽，董仲華，香紅星. 微量元素氨基酸(小肽)螯合物的研究應(yīng)用進(jìn)展［J］． 飼料工業(yè)，2002，23(1):15 －18.

［4］ Miquel E，F(xiàn)arré R． Effects and future trends of casein phosphopeptides on zinc bioavailability ［J］． Trends in Food Science ＆ Technology，2007，18(3):139 －143.

［5］ Bao X L． A study of the soluble complexes formed during calcium binding by soybean protein hydrolysates ［J］．Journal of Food Science，2008，73(3):C117 －C121.

［6］ Rui X. Calcium binding of peptides derived from enzymatic hydrolysates of whey protein concentrate［J］． International Journal of Dairy Technology，2009，62(2):170 －173.

［7］ Lee S H，Song K B. Article isolation of a calcium-binding peptide from enzymatic hydrolysates of porcine blood plasma protein［J］． Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry，2009，52(3):290 －294.

［8］ Nemirovskiy O V，Gross M L. Intrinsic Ca ＜ sup ＞2 +＜/sup ＞ affinities of peptides:application of the kinetic method to analogs of calcium-binding site III of rabbit skeletal troponin C［J］． Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2000，11(9):770 －779.

［9］ 袁道強(qiáng)，王丹丹，扶慶權(quán). 小麥胚蛋白的研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］． 糧食與飼料工業(yè)，2007(2):9 －11.

［10］ Ho Y P. Relative calcium ‐ binding strengths of amino acids determined using the kinetic method ［J］． Rapid Communications in Mass Spectrometry，2007，21(6):1 083 －1 089.

［11］ Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 ［J］． Nature，1970，227(5259):680 －685.

［12］ Yang B. Amino acid composition，molecular weight distribution and antioxidant activity of protein hydrolysates of soy sauce lees ［J］． Food Chemistry，2011，124(2):551 －555.

［13］ Zhuang Y. Antioxidant and melanogenesis ‐ inhibitory activities of collagen peptide from jellyfish (Rhopilema esculentum)［J］． Journal of the Science of Food and Agriculture，2009，89(10):1 722 －1 727.

［14］ Zhu K，Zhou H，Qian H． Antioxidant and free radicalscavenging activities of wheat germ protein hydrolysates(WGPH)prepared with alcalase［J］． Process Biochemistry，2006，41(6):1 296 －1 302.

［15］ Jung W -K，Kim S -K. Calcium-binding peptide derived from pepsinolytic hydrolysates of hoki (Johnius belengerii)frame［J］． European Food Research and Technology，2007，224(6):763 －767.

［16］ 張祥麟. 絡(luò)合物化學(xué)［M］． 北京:冶金工業(yè)出版社，1979:17 －65.

［17］ Yu Y，D Fan． Characterization of the Complex of Humanlike Collagen with Calcium［J］． Biological Trace Element Research，2012，145(1):33 －38.

［18］ 中本一雄著. 黃德如，汪仁慶譯. 無機(jī)和配合物的紅外和拉曼光譜［M］． 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1991:258 －265.